PCR及分子标记
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
综述-分子标记
分子标记遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。
遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。
形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。
虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。
从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。
一、分子标记的概念分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。
广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。
而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。
二、分子标记的特点理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。
目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。
三、分子标记的分类分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
分子标记-RAPD和ISSR
二、基于PCR技术的分子标记 二、基于PCR技术的分子标记
随机扩增多态性DNA（ 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple Sequence Repeat， ）、简单重复序列 Repeat， SSR) 、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length 扩增片段长度多态性(Amplified Polymorphism， Polymorphism，AFLP )、ISSR（ inter-simple )、ISSR（ intersequence repeat ）
ISSR DNA-PCR扩增结果（示例）： 扩增结果（示例）： 扩增结果
ISSR引物 U807对两种铁皮石斛的扩增结果
ISSR引物 U826对两种铁皮石斛的扩增结果
分子标记类型
现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 标记技术已有几十种 一、基于分子杂交的分子标记 这类标记利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同 生物体的DNA分子 然后用特异探针进行杂交， 分子， 生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放 射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性 的多态性。 射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。 （一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment 限制性片段长度多态性（ Length Polymorphism，RFLP） Polymorphism，RFLP） 小卫星DNA（ DNA） （二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）
RAPD (random amplified polymorphic DNA） ）
PCR-RFLP
步骤
• • • • • ( 1) 选择目标序列 ( 2) 设计特异引物 ( 3) PCR扩增 ( 4) 酶切 ( 5) 琼脂糖电泳分离与鉴定
特点
• (1) 引物与限制性内切酶组合非常多, 增加了揭示多态性的 机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析; • (2) 在真核生物中,CAPS标记呈共显性, 即可区分纯合基因 型和杂合基因型; • (3) 所需DNA的量很少, 且对DNA的浓度要求不严格; • (4) 使用的引物较长, 扩增的结果比较稳定且避免了RFLP 分析中膜转印这一步骤, 又能保持RFLP分析的精确度; • (5) 操作简便、快捷和自动化程度高。
PCR-RFLP
分子标记
• 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。 • 某种意义上分子标记也指DNA分子标记, 就是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。它能 够直接反映基因组DNA间的差异。
原理
• PCR-RFLP是酶切扩增多态性序列标记技术, 又称为 CAPS, 主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分 析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物, 将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。 • 基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异 性的PCR引物( 19~27bp) , 然后用这些引物扩增该位点上 的某一DNA片段,接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物,凝胶电泳分离酶切片SCP的比较
应用
• 植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定和动物的遗传多样 性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定等方面。
小概念
• DNA的多态性(不同个体间基因组的核苷酸序列存在的差 异性)可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多 态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到 长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一 段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否产生同 样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶的识别位 点时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为 多态性位点。
分子标记
分子标记百科名片分子标记分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
目录分子标记的概念理想的分子标记的要求一、基于分子杂交技术的分子标记技术二、基于PCR技术的分子标记技术三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记四、基于DNA芯片技术的分子标记技术分子标记的应用领域分子标记技术的展望分子标记的概念理想的分子标记的要求一、基于分子杂交技术的分子标记技术二、基于PCR技术的分子标记技术三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记四、基于DNA芯片技术的分子标记技术分子标记的应用领域分子标记技术的展望展开编辑本段理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。
但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。
此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。
①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。
RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。
分子标记种类及概述
分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。
分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。
作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。
与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
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车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出
来的”。
发展过程：
开始使用大肠杆菌•DNA聚合酶Klenow片段，
该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。
耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使
得自动化。
生命经纬
专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将 决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971 年PCR•的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并 公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学 Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认 为，任何具备生物技术知识的人都可以从 Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
生命经纬
primes If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-ends of the primers. Can amplify fragments over 10kb in length
the primers to bind, ❖ 72℃ polymerization step. ❖ Mg2+,dNTPs are required in addition to
template,primers,buffer and enzyme
生命经术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、 1968年诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并 不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘:
Store:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃； 冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体 状态于-20℃可保存6个月。不用时应20℃保存。
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属 Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一 项与•PCR有关的专生命利经纬并ww要w.bi求对方赔偿以及不再销 售与PCR有关试剂和仪器
PCR发展速度
惊人，没有一种技术能与之相比
引用论文最多、应用范围十分广泛
1993•年度诺贝尔化学奖：Mullis，与
生命经纬
procedures
v template(DNA or RNA),
v primers, v Taq enzyme, v 10×PCR buffer, v Mg++, v 5mmol/L dNTPs
v pre-denaturation-denature completely
v Denaturation v annealing v Elongation v cycles:25-30
生命经纬
Primer design
Most imp.
(1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with nonspecific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加
拿大籍英国科学家Michael Smith共
获
生命经纬
原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混 合物冷却至某一温度，这一温度可使引物 与它的靶序列发生退火，再将温度升高使 退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个 PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种 循环的不断重复。
PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation,
primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction
生命经纬
The PCR cycle
❖ 95℃ step to denature the duplex DNA, ❖ An annealing step of around 55℃ to allow
生命经纬
Primer designed with the help of computer
DNA database conservative region comparision primers or blast
生命经纬
PCR reaction components and their functions
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引 物；
当时(1970)Smith等发现了内切酶， 体外克隆基因成为可能 生命经纬
Kary Mullis(1985)
发明过程
Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写
到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝
DNA片段的方法是在不可想象的情况下， 即驾
template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA
samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable