链霉菌基因 bacB 和 bacC 的克隆和两者间的关系文献翻译

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一种在大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌之间穿梭表达的BAC载体及其构建

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101302531A [43]公开日2008年11月12日[21]申请号200810122910.1[22]申请日2008.06.20[21]申请号200810122910.1[71]申请人南京师范大学地址210046江苏省南京市亚东新城区文苑路1号[72]发明人尚广东黄慧颖宋杰 [74]专利代理机构南京知识律师事务所代理人卢亚丽[51]Int.CI.C12N 15/63 (2006.01)C12N 15/65 (2006.01)权利要求书 1 页说明书 24 页附图 2 页[54]发明名称一种在大肠杆菌－链霉菌－假单胞菌之间穿梭表达的BAC载体及其构建方法[57]摘要本发明涉及在大肠杆菌－链霉菌－假单胞菌之间穿梭表达的BAC载体及其构建方法。

所说的BAC载体，其含有pUC18的复制子，氨苄青霉素抗性基因，接合转移片段oriT，attP位点，整合酶基因int，Am 抗性基因，假单胞菌的PP_0423′基因的 5′端，假单胞菌的crp基因，BAC载体的redF基因、复制区OriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、cos位点和loxP位点。

本发明是从pECBAC1出发，将异源表达的必需原件加以有效综合和优化，并运用基因克隆和重组工程等手段，成功构建了穿梭表达BAC载体，为异源表达生物合成基因蔟以及高通量筛选方面提供了方便。

200810122910.1权利要求书第1/1页 1、一种B A C载体，其特征在于，其含有p U C18的复制子、氨苄青霉素抗性基因、接合转移片段oriT、整合位点attP、整合酶基因int、阿普霉素抗性基因、假单胞菌的PP_0423′基因的5′端、假单胞菌的crp基因、BAC载体的redF 基因、B A C载体的复制区O r i S、B A C载体的r e p A基因、B A C载体的s o p A 基因、B A C载体的s o p B基因、B A C载体的s o p C基因、B A C载体的c o s位点和BAC载体的loxP位点。

专题05 遗传的分子基础(教学案)-2019年高考生物二轮复习精品资料(解析版)Word版含解析

1．从考查内容上看，DNA是遗传物质的实验、DNA的结构和复制、遗传信息的转录和翻译是常考点。

2．从考查角度上看，结合细胞分裂、基因突变考查DNA结构与复制和遗传信息的转录、翻译；以实验分析形式考查DNA是遗传物质。

3．从一、遗传物质探究的经典实验1．肺炎双球菌转化和噬菌体侵染细菌两实验的比较①实验思路相同：都是设法把DNA和蛋白质分开，只是肺炎双球菌转化实验利用了从S型菌直接提取分离，而噬菌体侵染细菌实验则利用放射性同位素间接将DNA和蛋白质分开②结论相同：都证明了．生物的遗传物质总结(1)“DNA 是主要的遗传物质”是总结多数生物的遗传物质后得出的，而不是由肺炎双球菌转化实验和噬菌体侵染细菌实验得出的。

(2)R 型细菌转化为S 型细菌的实质是S 型细菌的DNA 整合到了R 型细菌的DNA 中，从变异类型看属于基因重组。

(3)噬菌体侵染细菌的实验中，两次用到大肠杆菌，第一次是对噬菌体进行同位素标记，第二次是将带标记元素的噬菌体与大肠杆菌进行混合培养，观察同位素的去向。

二、DNA 分子的复制、转录和翻译1．基因对性状的控制 (1)中心法则解读：①以DNA 为遗传物质的生物(绝大多数生物)的中心法则。

②以RNA 为遗传物质的生物的中心法则(如RNA 病毒等)。

a ．具有RNA 复制功能的RNA 病毒(如烟草花叶病毒)。

b ．具有逆转录功能的RNA 病毒(如艾滋病病毒)。

(2)基因与性状间的关系：基因与性状并非简单的一一对应的关系，可存在如下情况。

①一个基因――→控制一种或多种性状； ②多个基因――――――→共同控制一种性状； ③基因之间可相互作用、相互影响，从而改变生物性状。

如蚕茧的黄色(A)对白色(a)是显性，与蚕茧颜色有关的基因还有B 、b ，且只有基因型为A bb 时，才表现黄色。

2．与碱基互补配对或DNA 复制相关的计算(1)据T 或U 可判断核酸种类，DNA 中含T ，RNA 中含U ，双链DNA 分子中嘌呤之和＝嘧啶之和，即A ＋G ＝T ＋C 。

链霉菌(Streptomyces TE66 ) MalQ基因克隆与原核融合表达

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):1024~1028*基金项目：江西省教育厅项目(赣财教[2004]18号 18)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.博士，副教授，主要从事食品生物技术研究。

Tel:07918329081;Email ：<shuixingw@>. 收稿日期:2007618 接受日期:2007719·研究论文· 链霉菌( ST66) 基因克隆与原核融合表达 *王水兴 1 **，付金衡 1 ，龚珩 2 ，郭勇 3 ，夏慧玲 1，韩林强 1(1. 南昌大学中德联合研究院，南昌 330047； 2.九江学院医学院，九江 332005；3. 华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510641) 摘要：利用PCR 方法获得 ST66基因，将该基因插入原核表达载体 pTrcCKS 中，对质粒所含外源片段双向测序，并经 BLAST 比较分析，发现其与GenBank 中报道的基因的同源性高达97%。

重组质粒 pTrc 转化大肠杆菌（）Top 10F'，经IPTG 诱导后以融合蛋白形式表达，SDSPAGE 电泳显示基因与(CTP:CMP3deoxyDmannooctulosonate cytidylyltransferase or CMPKDO synthetase)基因表达的融合蛋白在目标位置约 106kD 处有明显条带。

经薄层层析分析粗酶液处理的麦芽三糖溶液，证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。

关键词：麦芽糖转糖基酶；基因克隆；融合表达；大环糊精；基因中图分类号:S188 文献标识码: A 文章编号:10061304(2007)06102405Cloning and Fusion Expression of the Gene fromWANG Shuixing 1 **， FU Jinheng 1 ， GONG Heng ２， GUO Yong 3 ， XIA Huiling 1 ，HAN Linqiang1The gene was amplified fromby PCR,cloned into pTrcCKS and sequenced. sequence was analyzed by BLAST and displayed high similarity (97%)to gene ofreported in GenBank.Therecombined plasmid pTrcwas transformed intoTop 10F'and induced by IPTG.gene and(CTP:CMP3deoxyDmannooctulosonate cytidylyltransferase or CMPKDO synthetase)gene fusion protein (molecular weight ： about 106 kD)could be detected by SDSPAGE gel electrophoresis.The crude enzyme was demonstrated having 4glucanotransferase activity with thin layerchromatography.amylomaltase;gene clone;fusion expression;cycloamylose;gene环状糊精是淀粉经酶降解而产生的，可以与疏水客体分子形成包合物，极大的改变了客体分子的物理化学特性，包括改变客体分子的水溶性、稳定性、挥发性以及药物分子的药效和口感等（Siegal ，1997； Sata ， 2001），甚至用于包埋去除一些有害物质（Rao ， 2000），在化学上用作催化剂（Granados and Rossi ， 2001）。

阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立

阿扎霉素F产生菌链霉菌211726基因转移系统的建立马艳玲;刘富来;张敏;孙宇辉;洪葵【摘要】The objective of this study is to establish the gene transfer system of strain Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F,which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign genes. Intergeneric genetic transfer system of Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F was constructed by conjugating integrative plasmid pSET152 with pIB139. Results showed that 25 mg/mL apramycin may be used to efficiently screen conjugants. PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of Streptomyces sp. 211726. The continuous passage culture experiment demonstrated that transformed pSET152 and pIB139 of conjugants were stably inherited.%旨在建立阿扎霉素F产生菌链霉菌211726的基因转移系统，以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。

bac同源重组原理

bac同源重组原理Bacillus anthracis is the bacterium responsible for causing the infectious disease known as anthrax. Bacillus anthracis is able to undergo recombination, which is a process in which genetic material is exchanged between different organisms or different strains of the same organism. This phenomenon, known as homologous recombination, plays a crucial role in the genetic diversity and evolution of Bacillus anthracis.炭疽芽孢杆菌是导致炭疽病的细菌，它能够进行同源重组，即在不同生物体或同一生物体的不同菌株之间交换遗传物质的过程。

这一现象在炭疽芽孢杆菌的遗传多样性和进化中起着至关重要的作用。

Homologous recombination in Bacillus anthracis occurs when two nearly identical DNA sequences are exchanged between different regions of the chromosome. This process is mediated by a family of proteins known as recombinases, which include RecA and RuvABC. RecA, in particular, plays a central role in promoting genetic exchange by facilitating strand invasion, branch migration, and resolution of recombination intermediates.炭疽芽孢杆菌中的同源重组发生在染色体的不同区域之间，当两个几乎相同的DNA序列进行交换时。

生物大数据_福建农林大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年

生物大数据_福建农林大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.翻译contig参考答案:跨叠克隆群##%_YZPRLFH_%##重叠克隆群##%_YZPRLFH_%##克隆重叠群##%_YZPRLFH_%##重叠群##%_YZPRLFH_%##克隆叠连群2.导致氨基酸改变的核苷酸变异称为__________突变，它又可分为错义突变或无义突变参考答案:非同义3.生物信息学主要是利用哪种工具实现对生命科学研究中生物信息的存储、检索和分析的？（）参考答案:计算机4.Proteomics的含义是（）参考答案:蛋白质组学5.被誉为“生物信息学之父”的科学家是（）参考答案:林华安6.利用PubMed文献数据查找论文“Transgenic plants of Petunia hybridaharboring the CYP2E1 gene efficiently remove benzene and toluenepollutants and improve resistance to formaldehyde”的第一作者是参考答案:Zhang D7.Bioinformatics的含义是（）参考答案:生物信息学8.核酸序列一个位点的InDel会引起编码蛋白质的________突变参考答案:移码9.全基因组中拷贝数变异CNV有5种形式,列举一种_________参考答案:缺失##%_YZPRLFH_%##串联复制##%_YZPRLFH_%##不连续的复制##%_YZPRLFH_%##高层次的复制##%_YZPRLFH_%##复杂的拷贝数变异##%_YZPRLFH_%##高层次的复制变异##%_YZPRLFH_%##不连续的复制变异##%_YZPRLFH_%##串联复制变异##%_YZPRLFH_%##缺失变异10.Q值低于___时，相应的读段应该过滤掉参考答案:3011.数据库提供了最全面和可靠的注释信息，被称为蛋白质序列数据的“黄金标准”。

链霉菌Streptomyces tenebrarius H6中与抗生素有关的糖生物合成基因的克隆

链霉菌Streptomyces tenebrarius H6中与抗生素有关的糖生物合成基因的克隆李天伯;尚广东;夏焕章;王以光【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2001(017)003【摘要】@@ 链霉菌S.tenebrarius H6产生多种氨基糖甙类抗生素,主要有阿普霉素、妥普霉素及卡那霉素B,其中阿普霉素因含有8碳糖的一种特殊结构令人注目,它的抗菌谱广,特别是对革兰氏阴性菌有较强的抗菌活性,不容易产生耐药性,对已有的耐药菌产生的氨基糖苷转移酶等失活酶仍有抵抗力.主要用于牛、猪、鸡等的大肠杆菌、沙门氏菌和支原体所引起的白痢、腹泻和肺炎等疾病.迄今有关八碳糖生物合成基因簇的研究在国内外尚无报道,在该菌株开展有关糖合成代谢基因的研究有着一定的意义.【总页数】4页(P325-328)【作者】李天伯;尚广东;夏焕章;王以光【作者单位】沈阳药科大学;中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所;沈阳药科大学;中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.链霉菌抗生素生物合成基因簇的克隆分析 [J], 肖勇立;袁丽蓉2.链霉菌聚酮体类抗生素生物合成基因的克隆和分析 [J], Sher.,DH;余柏松3.链霉菌抗生素生物合成基因的克隆策略 [J], 马云鹏4.海洋放线菌Streptomyces koyangensis SCSIO 5802中多烯大环内酯类抗生素candicidin生物合成基因簇的分析鉴定 [J], 涂佳佳;鞠建华;付少彬;李青连5.链霉菌ATCC55365中噻唑肽类抗生素GE37468生物合成基因簇的鉴定及其在变铅青链霉菌中的异源表达 [J], 吴慧玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌穿梭表达BAC载体的构建

大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌穿梭表达BAC载体的构建黄慧颖;宋杰;尚广东【摘要】异源表达生理活性物质的生物合成基因簇是药物研发领域的一个重要的方向,它可通过异源表达来研究基因功能,获得目标化合物或对现有的化合物进行结构改造.生物合成基因簇一般较大,常规的DNA载体由于容量不足、拷贝数较低或不能在不同的异源宿主间穿梭表达而难以对其进行操作.本研究运用重组工程策略和常规的克隆手段,将多个异源表达所必须的功能基因克隆至常用的构建BAC文库的载体pECBAC1,获得了一个可在大肠杆菌-链霉菌一假单胞菌3个常见的异源表达宿主间进行穿梭表达的BAC载体.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(033)002【总页数】5页(P104-108)【关键词】BAC载体;重组工程;穿梭表达【作者】黄慧颖;宋杰;尚广东【作者单位】南京市微生物工程技术研究中心,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京,210046;南京市微生物工程技术研究中心,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京,210046;南京市微生物工程技术研究中心,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京,210046【正文语种】中文【中图分类】Q819微生物是临床使用药物的主要来源.随着越来越多的微生物基因组被解析,微生物基因组资源的充分利用成为微生物药物学研究领域的一个热点.作为一种重要的基因工程手段,微生物药物生物合成基因簇的异源表达在:①常规方法难以或不能培养的生理活性物质产生菌的遗传操作;②产量极低而通常发酵难以进行的化合物的研究;③因结构复杂而使得化学合成难以进行或因收率极低而不能运用于工业化生产的化合物的研究等方面有着其它方法无可比拟的优越性[1-3]. 大肠杆菌(Escherichia co li),链霉菌(Streptom yces.sp)和假单胞菌(Pseudom onas.sp)是最为常见的3种生物合成基因簇异源表达的宿主菌,三者各有其优点[4-6].微生物药物的生物合成基因簇常常较大(数十至上百kb),常规的克隆载体以及粘粒载体(cosm id),fosm id等由于容量有限(最大可达45 kb)而不能在一个载体中涵盖完整的生物合成基因簇,而基因簇分布在两个甚至多个载体上则牵涉载体的抗性筛选标记、载体的兼容性以及DNA之间和蛋白质之间相互作用效率可能受影响等等问题.BAC(BacterialA rtificialCh romosom e)载体,即细菌人工染色体载体,由于具有可克隆大片段(多至300 kb)、所克隆的外源片段可在宿主内稳定存在(不发生缺失,扩增,重组)等特点而成为克隆和异源表达的首选载体之一[7,8].通常使用的BAC载体为单拷贝(1～2个分子/细胞),这样在进行DNA操作以及获取足够量的DNA方面有许多困难.而且迄今的BAC载体多为在大肠杆菌中进行操作,缺乏可在大肠杆菌、链霉菌和假单胞菌3个宿主之间穿梭表达BAC载体.本研究综合运用常规的基因克隆方法和重组工程(recom bineering)方法[9,10],从构建基因文库常用的BAC载体pECBAC1[11]出发,将异源表达的必需原件加以有效地综合和优化排列,构建了新型的大肠杆菌链霉菌假单胞菌的穿梭表达的BAC载体.1.1.1 菌株和质粒含重组酶质粒的菌株HS996/pSC101-BAD-gbaA由德国D resen University张友明博士惠赠;pECBAC1由美国加州大学戴维斯分校R ichard M ichelmore教授惠赠;菌株E.coli DH10B,P.pud ita KT2440;质粒pUC18,p IJ2925,pB luescrip t KS(-)和pSET152均为实验室保存.1.1.2 试剂和仪器p fu聚合酶购自上海生工公司;各种限制性内切酶,T4 DNA连接酶和DNA B lunting试剂盒购自TaKa-Ra B iotechnology公司(大连);其余试剂均为分析纯.PCR引物由上海生工公司合成;PCR仪为B io-Rad公司的DNA Engine;电转化仪为B io-Rad公司的Gene Pu lser II.1.1.2 DNA序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成.1.2.1 分子生物学常规操作大肠杆菌培养,感受态细胞的转化,质粒提取,鉴定等按手册[12]进行.1.2.2 表达重组酶的菌株HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC电转化感受态细胞的制备将HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC单菌落接种至3mL 10μg/mL四环素及12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基,于30℃过夜振荡培养,按1/50的体积转接至20m L同样的培养基,30℃振荡培养,至A600为0.2时,加入终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖,37℃振荡培养至A600为0.4时,12 000 r/m in,4℃离心3m in,弃上清,以10%的甘油洗涤沉淀2次,最终悬浮于200μL 10%的甘油中.50μL分装,用于一次转化.1.2.3 PCR扩增反应体系:2.5mmo l/L dNTP,1μM引物,2.5mmo l/L M gCl2,100 ng染色体DNA(或20 ng质粒),5U p fu,5%DM SO,加ddH2O至100μL.97℃处理5m in 后,PCR循环条件:97℃45 s,60℃1m in,72℃3m in,共30个循环,最后在72℃延伸10m in.本研究所使用的PCR引物及测序引物见表1 ,引物中同源臂部分以小写表示,酶切位点以下划线表示.将pECBAC1和pUC18均以Bam H I酶切,沉淀,回收,连接,转化E.co li DH 10B 感受态细胞,转化液涂布至含12.5μg/mL氯霉素,50μg/mL氨苄青霉素,20μg/mL IPTG和40 gμg/mL X-Gal的LB固体平板上,37℃培养过夜.挑取白色菌落,提取质粒,酶切验证,pUC18可以两个方向引入pECBAC1,酶切验证重组质粒,选取一个方向的克隆,命名为pEPUBAC.pEPUBAC兼具pECBAC1和pUC18的功能,为高拷贝的BAC载体.首先将pEPUBAC上含Xba I位点的2.1 kb Bg l II片段克隆至p IJ2925(pUC18的衍生载体,其多克隆位点两侧均为Bg l II位点),得到pBG2.以Xba I酶切pBG2,通过T4 DNA聚合酶和dNTP的作用,使得Xba I位点的序列TCTAGA变为TCTAGCTAGA,这样即去除了Xba I位点.测序证明序列正确后,将所得克隆命名为pBG-2.将pBG-2上Bg l II2.1 kb片段克隆至pEPUBAC Bg l II酶切的8.0 kb大片段,酶切验证克隆方向正确后,得到pEXPUBAC.pEXPUBAC只有在多克隆位点上存在单一的Xba I位点.以pSET152为模板,引物A 1和A 2扩增0.9 kb的阿普霉素抗性基因(Am)片段,以Bam H I和Pst I酶切后,克隆至pB luescrip t KS(-)相同位点,所得克隆测序正确后,命名pAM.以P.pud ita KT2440的基因组DNA为模板,引物C1和C2扩增1.0 kb的crp区域,Pst I和Eco R I酶切后,克隆至pB luescrip tKS(-)相同位点,所得克隆测序正确后,命名为pCRP.将pAM的Bam H I和Pst I0.9 kb,pCRP的Pst I和Eco R I1.0 kb与Bam H I和Eco R I处理的pB luescrip t KS(-)三片段连接,得到包含Am-crp-PP0423′基因盒的克隆pAC.运用重组工程原理,将2个DNA片段同时克隆至靶载体并去除靶载体相应部位的“三片段克隆”的策略是:上下游2个片段分别在其5′和3′端引入与靶载体的同源臂(同源臂即相同序列的一段核苷酸序列),上游片段的3′端和下游片段的5′端之间也有同源臂,同源臂常常是通过PCR的引物而引入.在大肠杆菌体内,L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达,重组酶催化3个同源臂之间的DNA重组.经过筛选,即可得到目的克隆.本研究所设计的引物SP1的前50个碱基(小写)为与pEXPUBAC氯霉素抗性基因3′端3397-3346序列相同的同源臂,后面为扩增pSET152 oriT部位的序列;SP2的51个碱基(小写)为pSET152整合酶基因(int)3′端的序列;SP3的前51个碱基(小写)为SP2的反向互补序列,后面为扩增Am-crp-PP0423′基因盒5′的序列;SP4的前50个碱基(小写)为与pEXPUBAC redF和氯霉素抗性基因5′端之间4107～4156序列相同的同源臂,后面为扩增Am-crp-PP0423′基因盒3′的序列.首先将pEXPUBAC转化至HS996/pSC101-BAD-gbaA,在30℃下,以10μg/mL 四环素和12.5μg/mL氯霉素进行筛选.所获菌株为HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC.以pSET152为模板,引物SP1和SP2扩增2.4 kb的oriT-attp-int基因盒,以pAC 为模板,引物SP3和SP4扩增2.6 kb的Am-crp-PP0423′基因盒.PCR反应体系乙醇沉淀,溶解于水后,以20U的Dpn I酶切4 h,胶回收,DNA溶于10mmol/LpH8.0 Tris.C l.将0.3μg的oriT-attp-int基因盒DNA片段和0.3μg的Am-crp-PP0423′基因盒DNA片段共转化至L-阿拉伯糖诱导重组酶表达的HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC.在37℃下,以50μg/mL阿普霉素和12.5μg/mL氯霉素加以筛选,所得的质粒再次转化E.co li DH 10B加以纯化,最终得到氯霉素抗性基因部分为oriT-attp-int基因盒和Am-crp-PP0423′基因盒所取代的目标载体pESPBAC.pESPBAC的质粒图谱见图1,酶切验证的结果见图2.设计表1 中的测序引物S1-S5,对pESPBAC中通过重组工程法所引入的4.3 kb进行测序,结果证明与预期完全一致.pESPBAC的GenBank收录号为EU 718182. 微生物药物生物合成基因簇的异源表达是药物研究领域的一个有前途的方向,其目的可包含:提高化合物的产量、获得新的药效学性质改善的衍生物以及改进化合物的提取分离纯化工艺.BAC载体已逐渐成为异源表达生物合成基因簇的常规载体,因此发展有效的BAC载体可以大大提高异源表达的效率,增加高通量筛选的成功率.重组工程是上世纪90年代末发展并逐渐成熟的一种在大肠杆菌体内利用重组酶催化而进行DNA之间同源重组的基因克隆手段.其优点在于不受任何酶切位点的限制,不引入碱基突变,快速高效.本研究充分运用重组工程和经典的基因克隆策略,构建了目标BAC载体pESPBAC.pESPBAC有如下5个特点:①大肠杆菌链霉菌假单胞菌3个宿主之间穿梭表达BAC载体.载体上的oriT片段同时供转移至假单胞菌和链霉菌.attp位点用来整合至链霉菌基因组的attB位点,而载体上假单胞菌基因组中的非必须基因crp 部分可以通过同源重组而整合至假单胞菌的基因组.这样,克隆在pESPBAC载体上的DNA片段在大肠杆菌中以游离质粒形式存在而进行表达,在链霉菌和假单胞菌中则为整合至基因组上进行表达.②保留了原BAC载体克隆大片段(可多至300 kb)的特点.保留了LacZ,可以使用蓝白斑筛选重组克隆.③pUC18作为填充片段克隆至Bam H I位点,使得BAC载体由单拷贝(1～2个分子/细胞)变为高拷贝(500～700个分子/细胞),这样基因操作如常规克隆载体一样简便易行.填充片段可以通过Bam H I切除,所得片段即为克隆大片段BAC载体.④去除了原载体pECBAC1一个多余的Xba I位点,这样可用位于载体的多克隆位点上克隆片段两侧的、链霉菌基因组上酶切位点较少的限制性内切酶Eco R I和Xba I将克隆片段切出,通过脉冲场凝胶电泳来鉴定克隆片段大小.⑤阿普霉素作为大肠杆菌链霉菌假单胞菌3个宿主的共同筛选标记.pESPBAC具有成为通用的高效表达次级代谢来源的生物合成基因簇的载体和运用于高通量表达化合物的潜力.【相关文献】[1] Tang L,Shah S,Chung L,et al.Ju lien B.C loning and heterologous exp ression of the epo thilone gene cluster[J].Science,2000,287(5453):640-642.[2] Long P F,Dun lapW C,BattershillCN,etal.Sho tgun cloning and hetero logous exp ression of the patellam ide gene cluster as a strategy to achieving sustainedm etabo lite p roduction[J].Chem biochem,2005,6(10):1 760-1 765.[3] W o lpertM,Heide L,Kamm erer B,et al.A ssem b ly and hetero logous exp ression of the coum erm ycin A 1 gene cluster and p roduction of new derivatives by genetic engineering[J].Chem biochem,2008,9(4):603-612.[4] PfeiferB A,Adm iraal SJ,Gram ajo H,etal.B iosynthesisof comp lex 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Bac to Bac

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种快速、高效产生重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）的技术（Luckow et al., 1993），利用细菌转座子原理，在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建，取名为Bac-to-Bac表达系统，意即从细菌（bacterium）到杆状病毒（baculovirus），革命性地改变了重组昆虫杆状病毒的构建方法。

其基本原理为：将一个改造后的AcNPV基因组转化入大肠杆菌，使它像普通质粒一样能在细菌中复制（由于太大，只限单拷贝），将其称之为杆状病毒穿梭载体（baculovirus shuttle vector，又称病毒质粒baculovirus plasmid，将其首尾合写而成为Bacmid），通过位点特异性转座，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。

杆状病毒穿梭载体Bacmid含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性选择标记基因及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。

在lacZα基因的N氨基末端插入一小段含有细菌转座子Tn7整合所需的靶位点（mini-att Tn7），但它的插入不影响lacZα基因的表达阅读框。

将杆状病毒穿梭载体（130kb）转化入大肠杆菌DH10β,获得转化子将其命名为DH10Bac。

因此，杆状病毒穿梭载体像一个大质粒一样，可以在大肠杆菌中增殖并使细菌细胞获得卡那霉素抗性，且与存在与受体菌染色体上的lacZα缺失产生互补，在IPTG诱导和X-gal或Blue-gal生色底物存在下转化体产生蓝斑（lacZ+）。

重组Bacmid通过pFASTBAC供体质粒（donor plasmid）上的mini-Tn7转座子，在另一个辅助质粒（helper plasmid，13.2kb）的功能作用下将外源目的基因插入到Bacmid中来完成。

Helper plasmid表达转座酶并含有四环素（tetracycline）抗性基因。

pFASTBAC系列供体质粒具有共同的特征：每个质粒都含有杆状病毒启动子（polh或p10启动子），在mini-Tn7左右臂间由一个完整的表达框，包括庆大霉素（gentamincin）抗性基因、杆状病毒启动子、多克隆位点及SV40 poly(A)。

链霉菌SH-62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达

第３４卷第６期２０１５年㊀１１月华㊀中㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l ．３４㊀N o ．６N o v ．２０１５,５５~６０收稿日期:２０１４Ｇ０６Ｇ２０基金项目:国家自然科学基金项目(３１２７０１３６);教育部留学回国人员科研启动基金项目([２００９]１５９０);教育部新世纪人才支持计划项目(N C E T Ｇ０８Ｇ０７７９)张㊀怡,硕士研究生．研究方向:微生物天然产物的生物合成．E Ｇm a i l :a yi i m u s i c ＠１６３．．c o m 通信作者:何㊀璟,博士,教授．研究方向:微生物天然产物的生物合成．E Ｇm a i l :h e j i n g j j＠m a i l ．h z a u ．e d u ．c n 链霉菌SH Ｇ62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达张㊀怡㊀鲁㊀洲㊀黄㊀胜㊀何㊀璟华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉４３００７０摘要㊀通过生物信息学分析,在链霉菌S H Ｇ６２的基因组中发现一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(e n t s ),与已报道的来源于S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s 的肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性.通过构建和筛选链霉菌S H Ｇ６２的基因组细菌人工染色体(B A C )文库,克隆得到完整的e n t s 基因簇.将e n t s 基因簇导入白色链霉菌中进行异源表达,H P L C 和L C ＧM S 分析结果表明该基因簇负责肠菌素的生物合成,从而证实了e n t s 基因簇的生物学功能.关键词㊀链霉菌S H Ｇ６２;肠菌素;细菌人工染色体;白色链霉菌;异源表达中图分类号㊀Q９３９．９㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀１０００Ｇ２４２１(２０１５)０６Ｇ００５５Ｇ０６㊀㊀广泛存在于自然界中的链霉菌能产生丰富的次级代谢产物.到目前为止,人们已经从链霉菌中分离鉴定出几千种抗生素,其中很多都已应用于临床诊治,如抗肿瘤药物博来霉素[１]㊁抗结核药物利福平[２]等.令人遗憾的是抗生素的滥用导致了耐药性病原菌的大规模出现[３Ｇ５].针对这种现象,科学家们一方面对耐药性病原菌的抗性机制进行了大量的研究[６Ｇ９],另一方面加大了新型药物的发掘.近年来,随着测序技术的飞速发展和测序成本的下降,研究者对越来越多的微生物进行了全基因组测序.科学家对模式天蓝色链霉菌的基因组序列分析发现其基因组上存在多达数十个次级代谢产物的生物合成基因簇,与其实际所产生的抗生素的数量存在较大的差异,引起了广大研究者的重视[１０].在已知基因组序列信息的基础上进行天然活性产物的发掘目前已经成为天然产物生物合成研究的一个热门方向.链霉菌S H Ｇ６２是１９８７年从湖北省房县土壤中分离得到的,对枯草芽胞杆菌㊁苏云金芽胞杆菌㊁金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有很好的抗菌效果.对啤酒酵母(S a c c h a r o m yc e s c e r e v i s i a e )㊁掷孢酵母(S p o r b o l o m yc e s r o s e u s )㊁卡尔斯伯酵母(S a c Ｇc h a r o m y c e sc a r l s b e r g e n s i s )㊁匐枝根霉(R h i z o p u s s t o l o n i f e r )㊁黄曲霉(A s p e r gi l l u s f l a v u s )以及多种植物病原真菌,如水稻恶苗病菌(G i b b e r e l l az e a e )㊁玉米小斑病菌(C o c h l i c o b o l u s h e t e r o s t r o ph u s )㊁柑橘青霉(P e n i c i l l i u mi t a l i c u m )㊁柑橘绿霉(P e n i c i l l i Ｇu md i gi t a t u m )㊁柑橘黑腐(A l t e r n a r i ac i t r i )和酸腐病菌(G e o t r i c h u m c a n d i d u m )都有良好的拮抗作用[１１].笔者所在课题组在链霉菌S H Ｇ６２基因组的生物信息学分析中,发现一个Ⅱ型聚酮合酶(P K S)基因簇与肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性.本研究通过构建链霉菌S H Ｇ６２的基因组细菌人工染色体(B A C )文库,利用克隆及异源表达的方法对这个Ⅱ型聚酮合酶基因簇的生物学功能展开研究.1㊀材料与方法1.1㊀材㊀料１)菌种和质粒.大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i )D H ５a 为基因克隆宿主,大肠杆菌S １７Ｇ１为大肠杆菌Ｇ链霉菌属间接合转移供体菌,大肠杆菌D H １０B(pU Z ８００２)为文库宿主.白色链霉菌和链霉菌S H Ｇ６２由笔者所在实验室收藏.质粒p O J ２６０和文库构建载体p M S B B A C 为笔者所在实验室收藏.２)培养基.大肠杆菌培养基为L B 固体㊁液体培养基,大肠杆菌链霉菌属间接合转移时孢子的处㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀理用T S B,接合转移用２C M,链霉菌发酵培养基为Y D.３)主要试剂.抗生素购自S i g m a公司,限制性内切酶购自F e r m e n t a s公司,T４D N A连接酶和K O DD N A高保真聚合酶购自T O Y O B O公司, D N A m a r k e r购自东盛生物科技有限公司,普通D N A凝胶回收试剂盒购自A x y g e n公司,T S B购自P r o m e g a公司,其余药品购自国药集团.研究涉及引物全部由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,测序反应由上海美吉生物医药科技有限公司负责. 1.2㊀方㊀法１)B A C文库的构建.将链霉菌S HＧ６２孢子接种于５０m L T S B中培养３６h,收集菌丝体,用蔗糖洗涤２次,T E２５S洗涤２次,加入等体积１．５％的低熔点琼脂糖制备包埋块.先使用１m g/m L溶菌酶在３７ħ水浴锅中进行２４h原位裂解,然后用含有１m g/m L蛋白酶K的N D S溶液在５０ħ水浴锅中进行２４h蛋白消化,２次.接着将包埋块挑出,放入含有０．０００１m o l/LP M S F的T Eb u f f e r中,４ħ轻轻振荡１h㊁２次,最后用T Eb u f f e r洗涤４次.选取最佳的B a m HⅠ部分酶切条件进行大量酶切,通过脉冲电泳对酶切片段进行分离,将包含有９０~２５０k b片段的凝胶切割下来,再次包埋到１．０％的琼脂糖凝胶中,通过脉冲电泳对酶切片段进行第２次筛选.然后将包含有所需片段的胶条切割下来,装入透析袋中通过电洗脱进行回收.回收好的大片段与处理好的载体进行连接,脱盐胶除盐后,电转化高效的大肠杆菌感受态细胞.从转化子中随机挑取１９个白斑,提取B A C的D N A,经H i n dⅢ酶切处理以检测插入片段的大小,经B a m HⅠ酶切处理以检验载体和插入片段.２)B A C文库的筛选.利用特异性引物S H０３６ⅡP K SＧ１F:５ᶄＧC A T C T G G C T G T T G C A T C G G T A A T CAＧ３ᶄ和S H０３６I I P K SＧ１R:５ᶄＧG C GC A G C G G G C A A T A A A A T C A TＧ３ᶄ㊁S H０３６I I P K SＧ２F:５ᶄＧG C G A C CC T G G C CC G G A A AC T ACＧ３ᶄ和S H０３６I I P K SＧ２R:５ᶄＧT C AC G CG C TA C CA G G A C A T C A A G AＧ３ᶄ对链霉菌S HＧ６２的基因组B A C 文库进行P C R筛选.首先筛选混合p l a t e库,然后根据结果筛选r o w库,随后得到阳性克隆子.P C R 扩增条件为９４ħ３m i n,９４ħ３０s,５４~６２ħ３０s,９４ħ３m i n,７２ħ１m i n,７２ħ１０m i n,３３个循环.３)异源表达菌株的构建.将阳性B A C导入大肠杆菌S１７Ｇ１,得到转化子.将转化子的过夜培养物转接在新鲜的L B培养基中,３７ħ培养转化子到D６００＝０．４~０．６时收集菌体.用等体积新鲜的L B 洗涤菌体２次,０．１倍体积的L B悬浮备用.同时将链霉菌孢子用T S B洗涤２次后,重新悬浮于T S B 中,５０ħ水浴热激１０m i n,３７ħ摇床培养２h,按１ʒ１的比例将处理好的大肠杆菌和孢子混合,均匀涂布在２C M平板上,３０ħ培养１６~２０h然后用１m L含有１m g安普拉霉素和０．８m g萘啶酮酸的无菌水覆盖,３０ħ培养２~３d后可观察到接合转移子出现.４)H P L C检测.检测波长为２５４n m,流动相为水和乙腈,洗脱条件如下:０~３０m i n乙腈由５％~９０％,３０~４０m i n乙腈９０％~５％,４０~４５m i n乙腈保持１０％,流速为０．５m L/m i n.H P L C色谱柱为D i k e m a T e c h n o l o g i e s公司的D i a m o n s i l C１８(２);L C１２６０高效液相色谱仪购自安捷伦公司.５)L CＧM S检测.在阳离子模式下,L C检测波长为２５４n m,流动相为水(含有０．１％甲酸,V/V)和乙腈,洗脱条件如下:０~８m i n乙腈５％~９０％,８~１０m i n乙腈保持９０％,１０~１５m i n乙腈９０％~５％,流速为０．３m L/m i n.仪器为A P I２０００L C/ M S/M S.2㊀结果与分析2.1㊀从链霉菌SHＧ62基因组中发现ents基因簇通过KＧm e r分析初步判断链霉菌S HＧ６２基因组大小约为９．６２M b.通过４５４和I l l u m i n a H i s e q ２０００平台２种方法进行测序分析,得到１５６个c o nＧt i g,组装长度约为１２．２４M b的序列信息.将１５６个c o n t i g的序列进行生物信息学分析,通过F G E N E S B㊁B P R OM㊁G e n e M a r k等分析O R F,利用p r o t e i nＧp r o t e i nB l a s t及P f a m分析注释基因可能的功能.在链霉菌S HＧ６２的基因组中发现有超过２０个次级代谢产物的生物合成基因簇,其中包含２个Ⅱ型P K S基因簇.其中一个与天蓝色链霉菌中负责孢子色素合成的基因簇w h i E具有很高的相似性,推测其参与链霉菌S HＧ６２孢子色素的合成.另一个Ⅱ型P K S基因簇除了包含有典型的M i n i m a l P K S(酮基合成酶α亚基(e n t A)㊁酮基合成酶β亚基(e n t B)和酰基载体蛋白(e n t C))负责聚酮链的起始㊁延伸和终止以外,还含有负责起始单元苯甲酸辅酶A合成(e n t P H I M J N L)㊁聚酮链后修饰(e n t D K Q R)６５㊀第６期张㊀怡等:链霉菌S H Ｇ６２中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达㊀和调控(e n t U E F S )的基因等(表１).将该基因簇命名为e n t s (G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e rK J ８６７５１６).它与来源于S t r e p t o m yc e s m a r i t i m u s 的肠菌素(e n t e r o c i n )生物合成基因簇同源性高达９０％,基因组成和排列方式也基本相同,唯一的不同是在基因簇５ᶄ端多了一个调控基因e n t s U (图１).表１㊀链霉菌S H Ｇ６２中肠菌素生物合成基因簇O R F 分析T a b l e １㊀O R Fa n a l ys i s o f t h e e n t s c l u s t e r i n S t r e p t o m y c e s S H Ｇ６２编码序列O R F氨基酸a a 同源性I d e n t i t y/％同源蛋白H o m o l o go u s p r o t e i n E n t s U １３０３３L y s Rf a m i l y r e g u l a t o r yp r o t e i n [M yc o b a c t e r i u m g i l v u m S p y r １]E n t s V ４９６３７S u l f a t e p e r m e a s e [S t r e p t o m y c e s r a p a m y c i n i c u s N R R L５４９１]E n t s E １８２９２P u t a t i v e r e g u l a t o r yp r o t e i nE n c E [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s F２８３９２P u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o rE n c F [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s G１５１９５E n c G [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s ]E n t s H ５６８９１P u t a t i v e a c y l ＧC o Al i g a s eE n c H [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s ]E n t s I２５８９０P u t a t i v e e n o y l ＧC o Ah y d r a t a s eE n c I [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s J ４００８４P u t a t i v e b e t a Ｇo x o a c y l ＧC o At h i o l a s eE n c J [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s K２４０９２P u t a t i v eO Ｇm e t h y l t r a n s f e r a s eE n c K [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s D２６６９４P u t a t i v ek e t o r e d u c t a s eE n c D [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s A ３９８９５P u t a t i v ek e t o s y n t h a s e a l p h aE n c A [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s B４０７９７P u t a t i v ek e t o s y n t h a s e b e t aE n c B [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s C ８２９５P u t a t i v e a c y l c a r r i e r p r o t e i nE n c C [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s L ３４０９３P u t a t i v e a c y l t r a n s f e r a s eE n c L [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s M ４６４９０P u t a t i v eF A D Ｇd e p e n d e n t o x y g e n a s eE n c M [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s N ５２２９５P u t a t i v e a r y l ＧC o Al i g a s eE n c N [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s O １３０８８E n c O [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s ]E n t s P ５３９９１P u t a t i v e p h e n y l a l a n i n e a mm o n i a l y a s eE n c P [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s Q ８１９０P u t a t i v e f e r r ed o x i nE n c Q [S t re p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s R ４０１９３P u t a t i v e p ４５０m o n o o x y g e n a s eE n c R [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s S ２１５９３P u t a t i v e r e g u l a t o r yp r o t e i nE n c S [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s T１１４９２P u t a t i v e e f f l u x p r o t e i nE n c T [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s]图１㊀链霉菌S H Ｇ６２中e n t s 基因簇的组成F i g ．１㊀O r g a n i z a t i o no f t h e e n t s c l u s t e r i n S t r e p t o m yc e s S H Ｇ６２2.2㊀链霉菌SH Ｇ62基因组BAC 文库的构建由于在野生型链霉菌S H Ｇ６２中无法进行遗传操作,本研究构建了该链霉菌基因组的B A C 表达文库,利用B A C 载体能够承载大片段D N A 的能力,希望能够克隆到完整的次级代谢产物生物合成基因簇.制备链霉菌S H Ｇ６２菌丝体的包埋块,经B a m HⅠ部分酶切处理后,回收并纯化大小约为９０~２５０k b 的片段,与笔者所在课题组构建的可装载链霉菌大片段D N A 的B A C 载体p M S B B A C s 进行连接,转化大肠杆菌感受态细胞D H １０B (pU Z ８００２),共获得２４００个B A C 克隆子.从中随机挑取２４个转化子,抽提质粒D N A ,通过H i n d Ⅲ酶切及脉冲电泳检测(图２),发现B A C 克隆子的插入片段大小为７５~１１０k b ,平均插入片段大小为８５k b ,可覆盖链霉菌基因组２５．５倍.2.3㊀链霉菌SH Ｇ62基因组BAC 文库的筛选为了克隆到完整的e n t s 基因簇,在基因簇两端分别设计了一对特异性引物,通过P C R 对链霉菌S H Ｇ６２的基因组B A C 文库进行了筛选.利用引物S H ０３６ⅡP K S Ｇ１F 和S H ０３６I I P K S Ｇ１R 筛选到８个阳性克隆,然后利用引物S H ０３６ⅡP K S Ｇ２F 和S H ０３６I I P K S Ｇ２R 对这８个克隆子进行复筛,发现其中６个出现阳性信号(图３),分别为１A １１㊁２E ３㊁５D ２㊁１１B １㊁１４B ８和１５A １０.７５㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀㊀随机挑取２４个B A C 克隆的D N A 通过H i n d Ⅲ酶切检测插入片段大小.泳道M 为N E BP F G E m a r k e r Ⅱ,泳道１~２４为B A C 克隆的H i n d Ⅲ酶切产物.D N Ao f ２４r a n d o m l y s e l e c t e dB A C c l o n e sw a s d i ge s t e dw i t h H i n d Ⅲ．L a n eM :N E BP F G E M a r k e rⅡ;L a n e １Ｇ２４:B A Cc l o n e s /H i n d Ⅲ．图２㊀脉冲电泳检测链霉菌S H Ｇ６２基因组B A C 文库插入片段的大小F i g ．２㊀P FG E r e s u l t s f o r a n a l y z i n g t h e i n s e r t s i z eo f c l o n e s i n t h e S t r e p t o m y c e s s p ．SH Ｇ６２g e n o m i cB A C l i b r a ry㊀泳道１~６分别为阳性B A C１A １１㊁２E ３㊁５D ２㊁１１B １㊁１４B ８和１５A １０;泳道M 为１００b p D N Al a d d e r .L a n e １Ｇ６r e pr e s e n t s t h e p o s i t i v e B A C１A １１,２E ３,５D ２,１１B １,１４B ８a n d １５A １０,r e s p e c t i v e l y ;L a n eM :１００b p DN Al a d d e r ．图３㊀使用引物对S H ０３６I I P K S Ｇ１(A )和S H ０３６I I P K S Ｇ２(B )对阳性克隆子进行P C R 扩增的结果F i g．３㊀P C R r e s u l t s o f t h e p o s i t i v eB A Cc l o n e sw i t h p r i m e r sS H ０３６I I P K S Ｇ１(A )a n dS H ０３６I I P K S Ｇ２(B )2.4㊀ents 基因簇的异源表达将６个阳性B A C 通过接合转移的方法从大肠杆菌导入白色链霉菌,筛选得到正确的异源表达菌株后,分别用不同的链霉菌发酵培养基进行发酵培养.利用生物活性测定㊁薄层层析㊁高效液相色谱(H P L C )等方法对发酵产物进行检测,发现其中１４B ８和２２D ９的异源表达菌株(S ．a l b u s ::１４B ８和S ．a l b u s ::２２D ９)可以产生抑制枯草芽胞杆菌１６８的活性物质(图４),暗示着这２个阳性B A C 可能在异源宿主中成功地进行了表达,催化合成出相应的代谢产物.使用Y D 培养基发酵５d 后,发酵产物经萃取浓缩,在２５４n m 波长下进行H P L C 分析时,异源表达菌株S ．a l b u s ::１４B ８和S ．a l b u s ::２２D ９与对照菌株S ．a l b u s ::p M S B B A C 相比在６．２m i n 保留时间处多了一个紫外吸收峰,薄层层析也显示出相似的结果.利用液相Ｇ质谱联用技术(L C ＧM S )进一步检测该紫外吸收峰,发现在阳离子模式下[M＋H ]为４４５．１１５(图４).在野生型链霉菌S H Ｇ６２和２个异源表达菌株中均检测到[M＋H ]＝４４５．１１５的离子流信号,而对照菌株中没有.由此,初步判定所克隆到的e n t s 基因簇为肠菌素生物合成基因簇,负责合成肠菌素.3㊀讨㊀论链霉菌S H Ｇ６２基因组中含有非常丰富的天然产物合成酶的基因资源,具有开发新型活性天然产物的潜力.本研究在全基因组序列分析的基础上,通过构建及筛选基因组B A C 文库,结合异源表达的方法,证实从链霉菌S H Ｇ６２中找到的一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(e n t s )负责肠菌素的生物合成.肠菌素是由日本学者从S t r e p t o m yc e sc a nd i d u s v a r ．e n Ｇt e r o s t a t i c u s W S Ｇ８０９６和S t r e p t o m yc e sv i r id o c h r o Ｇm o ge n e s M Ｇ１２７这２株土壤链霉菌中分离得到的一种具有广谱抑菌活性的抗生素.２０００年,J o e r nP i e l８５㊀第６期张㊀怡等:链霉菌S HＧ６２中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达㊀图４㊀异源表达菌株的生物活性测定和L CＧM S分析F i g．４㊀B i o a s s a y a n dL CＧM Sa n a l y s e s o f h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n p r o d u c t s o f t h e e n t s b i o s y n t h e t i c g e n ec l u s t e r等[１１]从S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s中克隆得到肠菌素生物合成基因簇.与放线紫红素不同,肠菌素的生物合成基因簇属于非典型的Ⅱ型聚酮合酶基因簇.除了不包含芳香类聚酮化合物合成所需的环化酶基因以外,该基因簇还含有独特的起始单元合成酶和装载模块[１２].起始单元合成相关基因e n c P编码苯丙氨酸裂解酶,它将LＧ苯丙氨酸脱氨形成反式肉桂酸,通过E n c H I J参与的β氧化最终形成苯甲酰辅酶A,参与肠菌素的合成,是细菌中首次发现的苯丙氨酸裂解酶[１２Ｇ１３].肠菌素对大肠杆菌㊁枯草芽胞杆菌㊁金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌等均有良好的抑制作用,但对真菌和酵母不具有任何活性[１４].而链霉菌S HＧ６２的发酵产物不仅对革兰氏阳性菌具有很好的抗菌效果,还能有效抑制酵母和丝状真菌的生长.从抗菌谱可以看出,链霉菌S HＧ６２的发酵产物中除了肠菌素以外,应该还包含有其他能够拮抗真菌的活性物质.在基因组测序技术日益成熟的今天,大量链霉菌的基因组序列开始公布.科学家发现从链霉菌中分离得到的抗生素与基因组中的生物合成基因簇的数目存在着巨大的差异.如何有效利用这些基因组的信息资源来发掘新型活性天然产物,是目前许多９５㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀科学家正在努力解决的问题.本研究基于全基因组和异源表达技术结合的策略,为充分利用基因组中基因簇的资源以及后续利用组合生物合成的研究来开发新型抗生素奠定基础.参考文献[１]㊀B L UM R H,C A R T E RSK,A G R EK．Ac l i n i c a l r e v i e wo f b l eＧo m y c i n a n e wa n t i n e o p l a s t i c a g e n t[J]．C a n c e r,１９７３,３１:９０３Ｇ９１４．[２]㊀A R I S T O F FPA,G A R C I AGA,K I R C HHO F FPD,e t a l．R i f aＧm y c i n sＧo b s t a c l e sa n do p p o r t u n i t i e s[J]．T u b e r c u l o s i s,２０１０,９０:９４Ｇ１１８．[３]㊀MO X N E S JF,D EB L A S I OBF,L E E G A A R D T M,e t a l．M eＧt h i c i l l i nＧr e s i s t a n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s(M R S A)i s i n c r e a s i n gi nn o r w a y:a t i m e s e r i e s a n a l y s i s o f r e p o r t e dM R S Aa n dm e t h iＧc i l l i nＧs e n s i t i v e S．a u r e u s c a s e s,１９９７－２０１０[J]．P l o S O n e,２０１３,８:e７０４９９．[４]㊀MA S C I N IE,B O N T E N M．V a n c o m y c i nＧr e s i s t a n t e n t e r o c o c c i:c o n s e q u e n c e s f o r t h e r a p y a nd i n fe c t i o n c o n t r o l[J]．C l i n i c a lM iＧc r o b i o l o g y a nd I n fe c t i o n,２００５,１１:４３Ｇ５６．[５]㊀T E L E N T IA,I M B O D E N P,MA R C H E S IF,e t a l．D e t e c t i o no f r i f a m p i c i nＧr e s i s t a n c em u t a t i o n s i n M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s [J]．T h eL a n c e t,１９９３,３４１:６４７Ｇ６５１．[６]㊀D WY E RDJ,K O HA N S K IM A,C O L L I N S J J．R o l e o f r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s i na n t i b i o t i ca c t i o na n dr e s i s t a n c e[J]．C u r r e n t O p i n i o n i n M i c r o b i o l o g y,２００９,１２:４８２Ｇ４８９．[７]㊀N G U Y E N L,T H OM P S O N CJ．F o u n d a t i o n so fa n t i b i o t i cr eＧs i s t a n c ei n b a c t e r i a l p h y s i o l o g y:t h e m y c o b a c t e r i a l p a r a d i g m[J]．T r e n d s i n M i c r o b i o l o g y,２００６,１４:３０４Ｇ３１２．[８]㊀S C HM I E D E R R,E DWA R D SR．I n s i g h t s i n t oa n t i b i o t i c r e s i s tＧa n c e t h r o u g hm e t a g e n o m i c a p p r o a c h e s[J]．F u t u r e M i c r ob i o l oＧg y,２０１２,７:７３Ｇ８９．[９]㊀C O L E MA N RS,P E R E ZRJ,B U R KC H,e t a l．S t u d i e s o n t h e m e c h a n i s mo f a c t i o no f a z i n o m y c i nB:d e f i n i t i o no f r e g i o s e l e cＧt i v i t y a n d s e q u e n c e s e l e c t i v i t y o f D N Ac r o s sＧl i n k f o r m a t i o n a n dc l a r i f i c a t i o no f t h e r o l e o f t h e n a p h t h o a t e[J]．J o u r n a l o f t h eAＧm e r i c a nC h e m i c a l S o c i e t y,２００２,１２４:１３００８Ｇ１３０１７．[１０]B E N T L E Y S,C H A T E R K,C E R D E N OＧT A R R A G A A M,e ta l．C o m p l e t e g e n o m e s e q u e n c e o f t h e m o d e l a c t i n o m y c e t eS t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A３(２)[J]．N a t u r e,２００２,４１７:１４１Ｇ１４７．[１１]P I E LJ,H E R TW E C KC,S H I P L E YPR,e t a l．C l o n i n g,s e q u e nＧc i n g a n da n a l y s i so ft h ee n t e r o c i n b i o s y n t h e s i s g e n ec l u s t e rf r o mt h e m a r i n e i s o l a t e S t r e p t o m y c e s m a r i t i m u s :e v i d e n c ef o rt h e d e r a i l m e n to fa n a r o m a t i c p o l y k e t i d es y n t h a s e[J]．C h e m i s t r y&B i o l o g y,２０００,７:９４３Ｇ９５５．[１２]H E R TW E C KC,MO O R EBS．A p l a n tＧl i k e b i o s y n t h e s i s o f b e nＧz o y lＧC o Ai n t h em a r i n eb a c t e r i u m S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s [J]．T e t r a h e d r o n,２０００,５６:９１１５Ｇ９１２０．[１３]X I A N G L,MO O R E B S．I n a c t i v a t i o n,c o m p l e m e n t a t i o n,a n dh e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o no f e n c P,an o v e lb a c t e r i a l p h e n y l a l aＧn i n e a mm o n i a l y a s e g e n e[J]．J o u r n a l o fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,２００２,２７７:３２５０５Ｇ３２５０９．[１４]M I Y A I R IN,S A K A IH,K O N OM IT,e ta l．E n t e r o c i n,an e wa n t ib i o t i ct a x o n o m y,i s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n[J]．T h eJ o u r n a l o fA n t i b i o t i c s,１９７６,２９:２２７Ｇ２３５．C l o n i n g a n dh e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o no f t h e e n t e r o c i nb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e r i n S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２Z H A N G Y i㊀L UZ h o u㊀HU A N GS h e n g㊀H EJ i n gS t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r a lM i c r o b i o l o g y,H u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,W u h a n４３００７０,C h i n aA b s t r a c t㊀B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２g e n o m es e q u e n c es h o w e dt h a t t h e r e w a s a t y p eⅡp o l y k e t i d e s y n t h a s e g e n e c l u s t e r(e n t s)h a v i n g h i g hh o m o l o g y w i t ht h e e n t e r o c i nb i o s y nＧt h e t i c g e n e c l u s t e r i n S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s．T h ee n t i r e e n t s c l u s t e rw a sc l o n e db y c o n s t r u c t i n g a n d s c r e e n i n g t h e g e n o m i c b a c t e r i a l a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e(B A C)l i b r a r y o f S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２．T h e e nＧt s c l u s t e rw a s i n t r o d u c e d i n t o S t r e p t o m y c e s a l b u s f o r h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n．T h e r e s u l t s o fH P L Ca n d L CＧM Sa n a l y s i s c o n f i r m e d t h a t t h e e n t s c l u s t e r i s r e s p o n s i b l e f o r t h e e n t e r o c i nb i o s y n t h e s i s i n S t r e p t oＧm y c e s s p．S HＧ６２．K e y w o r d s㊀S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２;e n t e r o c i n;b a c t e r i a l a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e(B A C);S t r e p t oＧm y c e s a l b u s;h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n(责任编辑:张志钰)０６。

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基因bacB和bacC的克隆和两者间的关系, bacB和bacC是链霉菌Streptomyces sp. TÜ4128 中参与抗生素bagremycin的生物合成中两个协同转录的基因.摘要: 由链霉菌Streptomyces sp. TÜ4128生产的抗生素bagremycin A 和bagremycin B , 对人腺癌细胞[1][2]显示抗肿瘤活性.为了阐明bagremycins 的生物合成途径, 从bagremycin-生产菌株中克隆到了两个名为：bagB和bagC基因, 并分析了两者的关系. bagB和bagC 诱导表达蛋白展示了分别同醛缩酶和3-脱氢硫胺素合成酶有很高的序列同源性.bagC 紧跟随在bagB 的下游位置, 并且随后的反转录和PCR分析发现两个基因是协同转录. BagB和bacC 两个任意一个沉默,都会使得发酵培养基中完全回收不到抗生素bagremycins , 这证明了两个基因都掺与了抗生素bagremycin的生物合成. 从本次的研究中, 获得了抗生素bagremycins整个生物合成簇基因, 近一步加深了我们对生物合成途径的理解以及bagremycins的活性机制.关键词：Bagremycin ，醛缩酶，3-脱氢硫胺素，Streptomyces sp. TÜ4128抗生素bagremycin A 和bagremycin B 是Streptomyces sp. TÜ4128生产的两种新型的-香豆酸衍生物, 对人腺癌细胞[1][2]显示抗肿瘤活性. Bagremycin A显示出对真菌病原菌: 白色念珠菌Candida albicans有活性, 而bagremycin B对病原体: 葡萄孢属-（脑脊髓）灰质炎病原体Botrytis cinerea[1][2]有直接活性。

因此，抗生素bagremycins 在未来的医药和农业应用中具有潜在的价值。

用X-射线和NMR光谱测量分析确定了bagremycin A 和bagremycin B的结构分别是：4-乙烯基·苯基醚-3-氨基-4-羟苯酸酯，4-乙烯基·苯基醚-3-N-乙酰基-4-羟苯酸酯，如图一[1][2]所示。

依据bagremycin A的结构，我们可以推测出bagremycin A 可能衍生于对-香豆酸和3-氨基-4-羟苯酸（3，4-AHBA）缩和反应产物的，在紧接着乙酰化反应就可以从bagremycin A得到bagremycin B （图一）。

3，4-AHBA---Streptomyces生产的许多代谢物的前体物---很可能是由醛缩酶和3-脱氢硫胺素（DHQ）合成酶[15]共同催化L-天冬氨酸-4-半醛（ASA）和二羟基丙酮磷酸（DHQ）发生缩和反应所得产物。

从Streptomyces griseus[15]克隆到负责上面所述及的反应的griI 和griH两个基因，并分析了两个基因在grixazone 生物合成途径中的关系。

同时，3，4-AHBA又是4-羟基-3-亚硝基苯甲酰胺（4,3HNBAm)的前体物，是在Streptomyces murayamaensis[13]中由两个蛋白NspI 和NspH 催化产生。

由此，我们可以猜测到，编码醛缩酶和3-脱氢硫胺素合酶的基因同样存在于bagremycins生物合成途径中。

在许多种微生物中，同样也发现了包含醛缩酶和3-脱氢硫胺素合酶的其它生物合成途径。

经典的莽草酸生物合成通路包含7步酶促反应，并且普遍存在于各种各样的微生物生物合成芳香氨基酸，叶酸，泛醌及大部分源于生物的苯衍生物[15]中。

第一步反应是由3-脱氧-D-阿拉伯-HEPTULOSONATE7-磷酸（DAHP）合成酶[16]催化发生的磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的缩合反应。

第二步反应由3-脱氢硫胺素合成酶引导完成的，其中把7碳糖DAHP 转化成脱氢硫胺素，并涉及到五步反应：乙醇的氧化，磷酸基团消除，羰基还原，开环和分子内的丁间醇醛缩和反应[11]。

然而，对于大多数的真核生物的基因组系列[14]中缺少经典合成通路的前两步反应所涉及到的同源系列。

在两种古生菌：Methanocaldococcus jannaschii和Methanococcus maripaludis[9]中，DHQ 实际上是由ASA和6-脱氧-5-酮果糖-1-磷酸（DKFP）产生而来的。

在过去的几十年里, DNA重组技术的发展, 通过生物合成途径的基因操作的方法,为改善抗生素的产量和生物活性提供了新的工具. 为此, 第一步是分离和分析bagremycins生物合成基因簇,这样才能阐明它们的生物合成途径; 第二步是尽力提高产量, 并通过重组生物合成和代谢途径工程的手段来加强抗生素的抗细菌和抗肿瘤的活性. 在这篇论文里, 我们克隆并分析了两个基因bagB,bagC这两个基因在Streptomyces sp. TÜ4128里负责bagremycins的生物合成. 并且通过RT-PCR的分析, 发现bagB 及其下游基因bagC是共同转录的.1材料和方法1.1 细菌菌株, 质粒, 生长条件.Streptomyces sp. TÜ4128[1][2]是一野生型产抗生素bagremycins菌株, 并被用于属间结合受体.含质粒pUZ8002[5]的甲基化缺陷型大肠杆菌Escherichia coli. ET12567用作结合供体. Escherichia coli. JM83 用作基因克隆宿主. pMD18-T被用于PCR产物的克隆载体.在制备链霉菌孢子时,用培养基MS在28o C下培养; 当制备菌丝体1[5]时用培养基YEME培养. 在生产抗生素时, 野生型菌株TÜ4128和它的变异体在发酵液1[1][2]中用28o C培养15天. 含80mM MgCl2的ISP4用于结合时用的培养基1[6]. Escherichia coli菌株于37o C下连续12-16h培养于LB 肉汤或LB 琼脂,并根据需要添加氨苄青霉素(100ugml-1), 阿泊拉霉素(50ugml-1),卡那徽素(50ugml-1)及氯霉素(25ugml-1).1.2 bagB,bagC基因的克隆.通过结合保守区域克隆和MICHIELS ET AL.(2003)描述的HE-TAIL PCR 的方法,获取基因bagB,bagC的完整系列. 本研究用的引物列于表S1 . 变性的引物P1+P2和P9 +P10分别用于克隆保守区域的bagB,bagC. 在HE-TAIL PCR 中, 用到变性引物AD1-AD4作为随机引物, 同时用到还有P3-P8及P11-P16. 在PCR反应中Streptomyces sp. TU4128的基因组的DNA作为模板.1.3 核苷酸系列登录号.Streptomyces sp. TÜ4128的基因bagB,bagC的核苷酸系列已提交至GENBANK 数据库,登录号分别为JN981134,JN981135.1.4 基因替换用bagB基因替换的质粒pECU2B构建如下: 克隆来自于带P25+P26的PGM91[10]的新抗生素基因片段,插入到含有梅切位点HindIII-BamHI的pOJ2601[3]中构建出pECU2. bagB基因的两个同源臂,来自于野生型含P17 +P18 和P19+ P20 的基因组的DNA, 用PCR进行扩增, 并分别连接到pMD18-T. 来自于上面构建的质粒中的HindIII 和BamHI 片段被成功地克隆到pECU2 中, 并构建出pECU2B, pECU2B以最小修饰方式被转化到先前由Flett et al. (1997) 描述的Streptomyces sp. TU4128中. 转化混合物涂布于转化培养基中, 并在37o C中培养16-18h. 然后, 在每个培养平板上用1ml含1mg 卡那徽素和0.5mg萘啶酮酸的水溶液覆盖. 得到对卡那徽素敏感的克隆, 近一步用复制平板法在筛选出对阿泊拉霉素敏感的克隆. 双交叉突变(Km r,Am s) bagB基因, 获得所要的ΔbagB突变体, 近一步被PCR 和RT-PCR验实. 类似于ΔbagB的方法, 用P21-24获得ΔbagC的突变体.1.5 RNA 分离和RT-PCR从发酵培养基中收集处于不同周期的Streptomyces sp. TÜ4128的菌丝体, 并投放于液氮中保存. 用EASY spin RNA Bacteria Mini KIT ( Aidlab, Beijing, China) 提取经预处理样本的总RNA. 用等同于总RNA量的DNase I (Takara) 处理样品,以除去所污染的DNA ; 然后用生产厂家推荐的反转录酶M-MLV(Takara)配上9-mer随机引物,再用处理过的样品RNA为模板启动合成第一条cDNA. 以cDNA 作为模板, 用三对特定的引物来做PCR: bagB基因用引物P29+P30, bagC基因用引物P15+P20, bagB,bagC之间的系列用引物P7+P31. 16S rRNA 用引物P27+P28来检测以作为阳性对照组.1.6 HPLC分析参照Bertasso et al.(2001,2004)的方法以最微小的影响来提取抗生素和HPLC分析. 把过滤后的培养液调至pH5, 在用等量的乙酸乙酯提取三次. 浓缩有机物层并干燥, 在把干燥物溶解于甲醇. 接下来在30o C下用HPLC(Model1100系列,Agilent Technologies , Wilmington, DE) 分析样品, HPLC 是以丙腈-0.1%磷酸(40%:60%, v/v)作为流动相, 用一种Eclipse XDB-C18(4.6*250mm)控制流速1ml min-1 , 并在280nm处检测样品.2 结果2.1 BagB, BagC的克隆和系列分析根据醛缩酶和3-脱氢硫胺素合成酶的高度保守区域, 设计了两对变性的引物并用于克隆来自于Streptomyces sp. TÜ4128的同源基因部分. TAIL-PCR(Liu and Whittier 1995; Michiels et al. 2003) ----一种用于分离已知染色体组的系列的侧边系列的基本PCR---用来获取两个假定的开放阅读框的整个系列. 如图Fig 2a 所示, 包含保守区域(F1)和两个侧边片段（F2，F3）的三个部分片段是交叠的并被切开产生了一个名为bagB假定的开放阅读框命。