抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析
人转铁蛋白基因的克隆及序列分析
人转铁蛋白基因的克隆及序列分析
王峰;黄璐圆
【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》
【年(卷),期】2007(028)002
【摘 要】目的:克隆人转铁蛋白基因并对其编码序列进行分析.方法:以人胎肝cDNA为模板,利用PCR方法克隆人转铁蛋白基因;通过与基因组序列对比分析基因组结构;通过TargetP 1.1和SignalP 3.0预测信号肽;通过Clustal X(1.81)进行蛋白序列联配.结果:PCR扩增了一个长2 160 bp的基因片断,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由698个氨基酸组成的人转铁蛋白.进一步分析发现人转铁蛋白基因有19个外显子和18个内含子,编码人转铁蛋白N端具有19个氨基酸组成的信号肽序列.人转铁蛋白与猩猩、猴子、兔子和老鼠的转铁蛋白氨基酸相似率分别为94%、91%、78%、73%.生物信息分析表明,人转铁蛋白含有高度保守的参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点,有两个序列较同源的结构域.结论:成功克隆人转铁蛋白基因,人转铁蛋白与其它物种转铁蛋白同源.
【总页数】5页(P111-114,119)
【作 者】王峰;黄璐圆
【作者单位】暨南大学药学院基因组药物研究所,广东,广州,510632;中国科学院广州生物医药与健康研究院分子医学中心,广东,广州,510633
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78 【相关文献】
1.延边黄牛转铁蛋白受体2基因克隆与序列分析 [J], 张立春;金海国;李赵志;任春宇;曹阳;周国利;金鑫
2.抗人树突状细胞单克隆抗体可变区基因克隆和序列分析 [J], 吕连峥;蔺昕;邵启祥;沈关心;王胜军;许化溪;刘恭植
3.鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因克隆和序列分析 [J], 李妍妍;杨笛;卞智萍;徐晋丹;陈相健;顾春荣;张寄南
4.大黄鱼(Pseudosciaena crocea)转铁蛋白(Tf)基因克隆及序列分析 [J], 李明云;陈 炯;张祖兴;管丹东;张呈念
嵌合抗体的制备
1 / 6 人-鼠嵌合抗体的制备
一、 概述
人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生。嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力，又大大减少了鼠源性在人体内的免疫原性，其半衰期明显延长，且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。
二、 市场分析
目前国内上市的单抗药物有11个，其中5个是国外进口产品，我国上市的自行开发的治疗性单抗药物的有6个，处于临床研究阶段的有5个(表6)。其中，武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3（注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体），也是最早批准上市的国内自行研制的抗体，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应；由北京百泰生物药业有限公司与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”（商品名：泰欣生）于2005年4月11日获得国家I类新药证书。这是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物，它的问世标志着我国在癌症靶向治疗和人源化抗体药物领域取得重大突破，该药主要用于治疗头颈部、食管、肺部、乳腺、结直肠等部位的上皮源性肿瘤；由第四军医大学、成都华神集团股份有限公司联合研制的碘［131Ｉ］美妥昔单抗注射液（商品名：利卡汀），于2005年4月20日获得国家I类新药证书。这是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。
附表是中国SFDA批准上市和进入临床的治疗型单抗药物
抗体名称 厂家 靶抗原 抗体类型 适应症 研发阶段
Muromonab-CD3 强生 CD-3 鼠源 抗移植排斥 批准上市
Rituximab 罗氏 CD-20 嵌合 B 细胞非霍奇金淋巴瘤 批准上市
Trastuzumab 罗氏 HER-2 人源化 乳腺癌 批准上市
Basiliximab 诺华 CD-25 嵌合 抗移植排斥 批准上市
人源化单克隆抗体的构建技术
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-- 人源化单克隆抗体的构建技术
摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建
从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human
anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析
生ＴＴ 技 术 通 讯ｖ…Ｎ。．１ ＪＬＥ ＲＳＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｏ１．Ｚｑ－ ｊａｎ．，…ＺＵＩ３ ＴＴＥ ｌ ０・ｌ ， ｊ ６ｌ
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１３．０１．０１４ 研究报告
甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区
基因的巢式ＰＣＲ扩增及序列分析
李慧瑾，李研，孙晶莹，高锦伟，赵向绒，封青，谭天天，胡巧侠，李元，胡军
陕西省人民医院中心实验室，陕西西安７１００６８
［摘要］ 目的：采用巢式ＰＣＲ对甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增，对获得的基因
进行序列分析，并找出克隆鼠ＩｇＫ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计２２对扩增鼠ＩｇＫ轻链可变区和重链
可变区基因的引物，对６株鼠抗人甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序，
与ＮＣＢＩ公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式ＰＣＲ方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因，并
且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可
变区基因的通用方法，为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础，并为研究甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒血凝
素与抗体的结合位点提供了实验数据。
［关键词］ 甲型Ｈ１Ｎ１流感病毒；单克隆抗体；可变区；巢式ＰＣＲ；序列分析
［中图分类号］Ｑ７８；Ｒ３９２．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１３）０１—００６１—０４
Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ
Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ａｇａｉｎｓｔ Ｈ１Ｎ１ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ
治疗性抗体的改造
医学分子生物学杂志,2006,3(4):245249JMedMolBio,l2006,3(4):245249
院士述评
治疗性抗体的改造
沈倍奋
军事医学科学院基础医学研究所北京市,100850
沈倍奋,中国工程院院士,军事医学科学院基础医学研究所研究员,博士生导师。中国人民解放军分子免疫学重点实验室主任。现任中华医学会副会长,中国发明家学会副理事长。从事单克隆抗体和基因工程抗体的研究和应用多年,近年来与不同学科的专家合作致力于基于抗原-抗体相互作用的立体结构信息设计新功能分子的研究。在国内外学术期刊上发表论文200余篇,主编专著4部。
【摘要】市场上已有18个被FDA批准的单克隆抗体,它们用于治疗如肿瘤、移植排斥、自身免疫病、病毒感染等人类疾病。治疗性抗体代表了生物制药业发展最快的领域之一。随着技术的发展,各种形式的工程抗体被构建来改善它们的特性和效能,包括:鼠抗体人源化,提高生物学活性,如亲和力成熟,改进效应功能,改善药代动力学。文章评述了这一领域的最新进展,同时也讨论了工程抗体的免疫原性和亲和力。【关键词】单克隆抗体;治疗性抗体;基因工程抗体;抗体人源化【中图分类号】R392116
ImprovementofTherapeuticAntibodies
SHENBeifenInstituteofBasicMedicalSciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing,100850,China
【Abstract】Inthemarke,tthereareeighteenmonoclonalantibodiesapprovedbytheFDATheyhavebeenusedtotreathumandisease,suchascancer,transplantrejection,autoimmudisease,antiviralprophylaxisandsoonThetherapeuticantibodiesrepresentoneofthefastestgrowingareasofthebiopharmaceuticalindustryWiththetechnologydevelopmen,tadiversityofengineeredantibodyformshavebeencreatedtoimprovetheircharacterizationandefficacy,includinghumanizationofmurineantibodies,enhancingtheirbiologicalactivitiessuchasaffinitymaturation,improvementofeffectorfunctions,andalteringpharmacokineticsThisreviewsummarizedrecentdevelopmentsinthisfield,alsodiscussedtheimmunogenicityandaffinityofengineeredantibodies【Keywords】monoclonalantibody;therapeuticantibody;engineeredantibody;humanizedantibody
抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链基因的串联及克隆
徐劲等：抗日本血吸虫卵单抗３３Ｆ５可变区轻、重链基因的串联及克隆 ・１ ７３・
：文章编号］１００５—６６６１（２００２）０３—０１７３—０３
抗日本血吸虫卵单抗３３Ｆ５可变区轻、重链
基因的串联及克隆
徐劲，吴忠道，陈守义，胡旭初，余新炳
［摘要］ 目的 制备抗日本血吸虫虫卵尿素溶性抗原单克隆抗体３３Ｆ５的基因工程单链抗体。方法 利用杂交瘤细胞总ｍＲＮＡ抽提、逆转录技术及ＰＣＲ方法、获得单抗重链和轻链可变区基因，通过
ｌｉｎｋｅｒ将其连接，并克隆到表达载体ＰＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中。结果酶切显示，重链和轻链可变区基因及 ＳｃＦｖ片段与预设计的大小一致。结论 获得抗日本血吸虫卵单抗３３Ｆ５可变区轻、重链串联的基因
克隆。 ［关键词］ 单链抗体；ＰＣＲ；可变区基因；基因克隆
：中图分类号］Ｒ３８３．２４ ［文献标识码］Ａ
ＬＩＧＡ’Ｉ＇１０Ｎ ＡＮＤ ＣＬ０ＮＩＮＧ ｏＦ ＴＨＥ ＶＡＲＩＡＢＬＥ ＲＥＧ１０Ｎ ＧＥＮＥＳ ０ ’ＡＮＴＩ－ＳＣＪ了ｊＳ ＤＳＤ Ａ ＥＧＧ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ３３Ｆ５ Ｘｕ Ｊｉｎ，Ｗｕ Ｚｈｏｎｇｄａｏ，Ｃｈｅｎ Ｓｈｏｕｙｉ，Ｈｕ Ｘｕｃｈｕ，Ｙｕ Ｘｉｎｇｂｉｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｈｏｏｌ，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８９， Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｇｓ ｏｆ
ａｎｔｉ—Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｅｇｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３３Ｆ５．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３３Ｆ５ ｈｙ— ｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌｓ．ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎ—
以反向PCR扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因
ＩＳＳＮ１００７—８７３８细胞与分子免搜学杂志（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｎ 【Ｉｌ 『１（１ ２ ００ ！ ４８９ 文章编号：１００７—８７３８（２００２）０５—４８９—０３ 以反向ＰＣＲ扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因 王 莹，李 旭，陈 葳 （西安交通大学第一医院实验ｆ 学中心，陕四两安７１００６１） 关键词：单链抗体；重链；叮变区；反向ＰＣＲ；寓颈癌 中图分类号：Ｒ７３７．３３ 文献标识码：Ｂ 单克隆抗体（ｍＡｂ）Ｖ区ｃＤＮＡ序列的克降是构建单链 抗体（ＳｃＦｖ）的关键一步 。通常是在抗体Ｖ区序列两头一５ 和３ 端设计带简并碱基的引物，用普通ＰＣＲ法进行扩增 。 该法虽看似简单，但局限性很大，若遇到同源性差且复杂的 序列，则难以获得。同时，因带有简并碱基，可使ＰＣＲ产物 不纯，而影响蛋白的表达及其功能。我们在构建抗人宫颈 癌ＳｃＦｖ过程中，用常规ＰＣＲ法扩增出Ｖ．ｃＤＮＡ序列．经多 种方法尝试，均未获得Ｖ．．ｅＤＮＡ序列。随后，采川反向 ＰＣＲ技术扩增并经测序证明，确为Ｖ ｅＤＮＡ序列，为重组 制备ＳｃＦｖ奠定厂基础。 ｌ材料和方法 １．１ 材料抗人宫颈癌的鼠杂交瘤细胞株ＣｓＤＡ为本实验 室建立。ＡＭＶ、３ 一ｆｕ１１ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ、５ 一ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ 及Ｔ ｖｅｅｔｅｒ，均由大连宝生物工程有限公司购买 引物的合 成及序列测定，由大连宝生物工程有限公司完成。 １．２方法 １．２．１ ３ 端未知序列的扩增３ ＲＡＣＥ是用特异性引物ａ和 Ｏｌｉｇｏ（（ＩＴ），以常规方法提取的ＣｓＤＡ细胞的总ＲＮＡ为模板， 反转录为ｅＤＮＡ，再扩增出ＤＮＡ双链。因扩增产物的特异 性高，故对其直接进行测序。主要步骤如Ｆ：①反转录ｃＤ． ＮＡ：提取总ＲＮＡ后，在２０ Ｉ 体系巾，加总ＲＮＡ １ Ｉ 、１０ ｘ ＲＮＡ缓冲液２ Ｌ、２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１，８ Ｉｘｌ 、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ ＩｘＬ、５ Ｕ／Ｉ￣Ｌ ＡＭＶ １ ＩｘＬ、４０ Ｕ／Ｉ￣Ｌ ＲＮＡ酶０．５ ＩｘＬ及２．５ ｐｍｏｌ／Ｌ Ｏｌｌｇｏ（ｄＴ）一３ 端带接头的引物Ｉ Ｌ、反应条件为： ３０℃１０ ｎｉｌｎ，５０℃３０ ｎｌｉｎ，９５℃５ ｎｌｉｎ．５℃５ ｎｌｉｎ，循环１ 次：②ＰＣＲ反应：所用引物及其序列如下：ａ：５ 一ＡＧＴ— ＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＹＡＡＧＧＣ一３ ： ＲＴ： ５ 一Ｐ—ＡＧＡＣＧＡ（，ＧＧＧ— ＧＡＡＧＡ一３ ；Ｓ】：５ 一ＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＴＦＧＴＣＣ一３ ；Ａ ：５ 一 ＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡ一３ ；Ｓ２：５ 一ＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴ— ＴＣＣＣＡＡＡＴ一３ ；Ａ，：５ 一ＧＧＣＣＴＦＧＴＣＣＴＦＧＡＡＣＴＦＣＴＧ一３ 。在 ８０ Ｌ的体系中，加上液，１０ ｘ ＬＡ缓冲液８ ＩｘＬ、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ １６ ＩｘＬ、ＬＡ Ｔａｑ聚合酶１ Ｕ及上游引物ａ １ ＩｘＬ。ＰＣＲ条 件为：９８￣Ｃ ３０ ｓ，５５￣Ｃ ３０ ｓ，７２￣Ｃ ２ ｒａｉｎ，共３０个循环 扩 增产物经２０ Ｉ 琼脂糖凝胶电泳，并以胶回收纯化。③测 序：以通用引物，在ＡＢＩ３７３自动测序仪上进行ＤＮＡ测序。 １．２．２ ５ 端未知序列的扩增 ＲＡＣＥ的扩增采用特异性引 物ｌｉＴ，以ｍｌＩＮＡ为模板，反转求出ｃＤＮＡ 、再将总ＲＮＡ降 解，将ｅＤＮＡ环化，朋两对特异性引物进行巢式扩增，然后 克隆测序，以ｒ解５ 端的序列。主要步骤为：①反转录ｃＤ— ＮＡ：在１５ Ｌ的体系中，加总ＲＮＡ １．５ ＩｘＬ、１０ ｘ ＲＴ缓冲液 １．５ ＩｘＬ、ＲＮＡ酶抑制剂０．５ ＩｚＬ、ＡＭＶ及５ ＲＴ引物各１ ｌ 。 反应条件为：３０℃１０ ｎｌｉｎ，５０℃６０ ｎｌｉｎ．８０￣Ｃ ２ ｎｌｉｎ，循环１ 次。②降解ＲＮＡ：取ｅＤＮＡ液１５ ＩｚＬ、１０ ｘ ｈｙｂｒｉｄ ＲＮＡ缓冲 液ｌ５ Ｌ，加双蒸水至７５ Ｌ，再加入ＲＮＡ酶１ Ｉｘｌ ，于３０℃ １ ｈ 、⑧ｃＤＮＡ环化：取５ ｘＲＮＡ连接缓冲液８ ＩｘＬ、４０％ＰＥＧ ＃６０００ ２０ Ｉ．Ｄ ，加蚁蒸水至４０ Ｉ 及Ｔ４ ＲＮＡ连接酶１ ｉｘＬ，于 １６℃降解１８ ｈ．．④第１次ＰＣＲ：在５０ Ｉ 的体系・ 加１ Ｉ 模板、１０ ｘ ＬＡ ＰＣＲ缓冲液１Ｉ（加Ｍｇ ）５ Ｌ、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮ ｌ＇Ｐ ８ Ｉ 、冉分别加入引物ｓ，、Ａ，各０．５ Ｉ 及Ｉ Ａ Ｔａｑ聚 合酶０．５ Ｉ ？反应条件为：９４℃３ ｎｆｉｎ，９４￣Ｃ ３０ ｓ．５５℃３０ ｓ，７２℃５ ｌｎｉｎ，共２５循环 ⑤第２次ＰＣＲ：在５０ Ｌ的体系 中，加第１次ＰＣＲ产物液１ Ｉ 、１０ ｘ ＬＡ ＰＣＲ缓冲液５ Ｉ 、 ｄＮＴＰ ８ ＩｚＬ、引物Ｓ 和Ａ！各０．５ ＩｚＬ、ＬＡ Ｔａｑ聚合酶０．５ Ｌ。 反应条件为：９４℃３ ｎｌｉｎ，９４℃３０ ｓ，５５℃３０ ｓ，７２ ５ ｒａｉｎ， 共２５个循环：ＰＣＲ产物经２０ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳．并以胶 【旦】收纯化： ＤＮＡ序列测定：同前述： １．２ ３普通ＰＣＲ已知目的序列伞长后， 序列两端没计 引物Ｆ和Ｒ（其序列分别为：Ｆ：５ 一ＧＣＧＧＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣ— ＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣｑＴＣＡＧＣＡＧＴＣ…１—３ ； Ｒ： ５ 一Ａ（ ＡＣＣＣＡＣＣＡＣ— ＣＡＧＣＧＣＧＣＴＦＡＡＧＴ１ ＣＴＧＡＧＧＡ（ ＡＣ【 ＧＴ（；ＡＣＴＧＡＧＧ一３ ． 划 线部分分别为 Ｉ酶切位点和ｌｉｎｋｅｒ）．进行普通ＰＣＲ扩 增 产物经２０ Ｌ琼脂精凝胶电泳，并以胶回收纯化。 ＤＮＡ序列洲定同前述。 ２ 结果 ２．１ ＰＣＲ产物长度分析以ｍＲＮＡ为模板．当以ａ和Ｏｌｉ— ｇｏ（（ＩＴ）为引物进行两轮普通ＰＣＩＩ后，得到长约１ ０００ ｂｐ的 特异性片段（图１Ａ）．．以ＲＴ为 ｊＩ物可扩增出单链ｃＤＮＡ。 收环化后，再进行嵌套式ＰＣＲ，扶得的特异片段约为 ２ ０００ ｂｐ（Ｉ刳１Ｂ） 以Ｆ、Ｒ为引物， 两轮普通Ｉ＇ＣＲ扩增后， 得到的特异性目的片段约为３９０ ｌ ＪＩ）， 颅｛ｔ－（￣０ ｖ．．ｅＤＮＡ序列 的长度相符（图２）。 ２．２抗人宫颈癌抗体Ｖ ｃＤＮＡ的序列分析 与ＧｅｎＢａｎｋ 叶１的已知序列相比较，证明ＰＣＲ扩增产物的洲序结果确为 抗人宫颈癌抗体Ｖ 基因序列。
抗人树突状细胞单克隆抗体可变区基因克隆和序列分析
第１７卷第５期
２００７年９月 江苏大学学报（医学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏ１．１７ Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００７
抗人树突状细胞单克隆抗体可变区基因克隆和序列分析
吕连峥 ，蔺 昕 一，邵启祥 ，沈关心 ，王胜军 ，许化溪 ，因盈
（１．滨海县人民医院检验科，江苏滨海２２４５００；２．江苏大学医学技术学院临床检验诊断学研究所，江苏镇江２１２０１３；３华中科技大学同
济医学院免疫学系，湖北武汉４３００３０）
［摘要］ 目的：为了将抗树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ＤＣ）抗体应用于ｌ临床疾病治疗，计划克隆获得抗人ＤＣ单克隆
抗体（ＭｃＡｂ）的可变区序列，在此基础上进一步获得人源化的抗人ＤＣ抗体。方法：运用ＲＴ—ＰＣＲ技术，从分泌抗人
ＤＣ ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株（ＨｌＥ１１）中，克隆出Ｖ 和Ｖ 基因片段，并对Ｖ 和Ｖ 进行了测序分析。所测得的重链和
轻链在基因库中与相关的Ｉｇ的Ｖ 和Ｖ 基因序列进行经Ｂｌａｓｔ同源性比较。结果：通过碱基和蛋白序列的比较确认
为小鼠ＩｇＧ的Ｖ 和Ｖ 基因。运用Ｄｎａｓｉｓ软件对Ｖ 和Ｖ 基因进行阅读框分析和模拟翻译，并参照Ｋａｂａｔ等人
（１９９１）编写的Ｉｇ蛋白质编码序列图谱，根据其ＦＲｓ和ＣＤＲｓ的序列特征进行Ｉｇ的家族分析，发现ＶＨ共有４１４ ｂｐ，编
码１３８个氨基酸序列，属于小鼠ＩｇＧ重链Ⅲ（Ａ）家族；Ｖ 由３９６ ｂｐ编码，产生１３２氨基酸，属于轻链ＫＶ家族。结论：
成功克隆抗人ＤＣ ＭｃＡｂ重链和轻链的可变区。
［关键词］ 树突状细胞；ＭｃＡｂ；可变区基因；克隆；序列分析
［中图分类号］ Ｒ３９２．１２ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １６７１—７７８３（２００７）０５—０３８１—０５
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ
抗CD3单克隆抗体重、轻链可变区基因的克隆及序列分析
中国免疫学杂志２ＯＯ２年第１８卷
抗ＣＤ３单克隆抗体重、轻链可变区基因的克隆及序列分析
张囡 陈明洁陈敬金海陵张爱华闭兰左建民王志友史良如
（武汉生物制品研究所免疫研究室，武汉４３００６０）
中国图书分类号Ｑ７８ 文献标识码Ａ 文章编号１０００－４８４Ｘ（２００２）０９．０６０８－０３ 摘要目的：抗ＣＤ３单克隆抗体（ＷｕＴ３）可变区基因克隆及序列分析。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＷｕＴ３杂交瘤细胞总 ＲＮＡ中扩增ｖＨ、ｖＬ片段，经酶切后通过链接反应构建重组克隆载体，测序鉴定。结果：通过国际联机检索发现ｖＨ、ｖＬ基因与 Ｉｇ同源，分别符合小鼠ＩｇｖＨ、Ｖｔ￣基因特征。ｖＨ基因属于鼠重链ｖＩ｛第皿亚类，全长３６３ ｂｐ，可编码１２１个氨基酸；Ｖ 基因属于 鼠．ｃ轻链第Ⅲ亚类，全长３３０ ｂｐ，可编码１１０个氨基酸。结论：成功获得ＷｕＴ３单抗的重、轻链可变区基因。 关键词ＣＤ３ ＭｃＡｂ ＷｕＴ３基因克隆ＤＮＡ序列分析
Ｏｏｎｈ￣ｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｇｅｎｅ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ＭｃＡｂ
ＺＨＡＮＧ Ｎａｎ，ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ－Ｊｉｅ，ＣＨＥＮ如 ｅｔ ａ１．Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６０
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抗体人源化介绍
抗体人源化介绍
一．什么是抗体人源化？
人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利于抗体应用于人体。
人源化抗体就是指抗体的恒定区部分（即CH和CL区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。
二．抗体人源化原理
1. 嵌合抗体：嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
2. 改型抗体：改型抗体也称CDR植入抗体（CDR graftingantibody），抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
3. 表面重塑抗体：表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。 4. 全人源化抗体：全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。
三．抗体人源化应用：
1. 在肿瘤治疗方面：单抗肿瘤药物能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。这些人源化单克隆抗体的研制主要是针对那些与肿瘤发生、发展相关的靶分子。还有一些人源化单抗是通过携带抗癌药物如毒素、细胞毒药物、放射性核素、酶、化疗药物等分子而发挥作用。这样偶联而成“生物导弹”，从而达到特异性杀伤癌细胞的作用。