细菌内毒素检测方法验证讲解
8、细菌内毒素检查的验证
定量法：标准曲线的验证实验。相关系数
|γ |≥0.980，可以平均或直接回归。
3、 供试品验证
3.1 目的：验证供试品在实验条件下对BET是否存在干 扰。所谓“在实验条件下”是指实验时供试品的状
况（浓度、pH值等）对实验所使用的具体厂家的试
剂的相容性。 3.2 验证项目及标准 凝胶法：供试品干扰试验，结果无干扰 定量法：供试品干扰试验。相关系数 |γ |≥0.980，回收率在50~200%
细菌内毒素检查的 验证
细菌内毒素检查的验证
1.
2.
3.
4. 5.
实验室的验证 试剂验证 供试品验证 干热除热原验证 定量检测设备的验证
1、 实验室验证
1.1 目的：验证实验室的条件以及实验员的实验 技能是否满足BET实验的要求。 1.2 验证项目及标准 凝胶法：鲎试剂标示灵敏度的复核试验。复 核结果应在标示灵敏度50~200%
– 2、运行确认（OQ）
包括软件运行密码的安全性确认，设备与软件 的连接通信、稳定性确认等； – 3、性能确认（PQ） 包括光学性能、温控性能、检测均一性能的确
认等。
3.3 验证方法 （1）验证前一般进行初筛试验，取一批样品挑选出 合适的验证浓度、方法； （2）取三批样品进行干扰验证试验； （3）可能的话，设置一个安全系数。
3、 供试品验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ（续）
3.3 验证失败的处理 1）分析失败的原因 2）消除干扰因素
3）重做验证实验
4、干热除热原验证
4.1目的：证明干热除热原过程的有效性。 4.2验证项目及标准 一般将内毒素指示剂加入待去热原的物品中，证
范围内。
定量法：标准曲线的可靠性试验。相关系数 |γ |≥0.980，但回归方式必须是直接
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分对细菌内毒素的检验方法主要包括以下几个方面：
1. 细菌内毒素的生物学活性测定：采用小鼠、兔等动物模型，通过观察动物的反应和生存情况来评价细菌内毒素的生物学活性。
2. 免疫学方法：利用抗体与内毒素结合反应，通过免疫沉淀、凝胶免疫扩散、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析等方法来定量或定性检测细菌内毒素。
3. 生理检验：通过动物模型中的生理变化来判断细菌内毒素的存在与活性。
比如利用皮肤红斑反应、大鼠血压升高、家兔体温升高等指标。
4. 生化检验：采用染色反应、化学方法、酶活测定等手段来检测细菌内毒素的存在与活性。
比如利用抗原-抗体反应进行凝集、沉淀、免疫层析等实验。
以上这些方法都是中国药典第二部分中针对细菌内毒素的常用检验方法。
不同的方法适用于不同的细菌内毒素类型和浓度范围，综合运用可以提高检测的灵敏度和准确性。
细菌内毒素检验方法验证方案
细菌内毒素检验方法验证方案一、背景介绍细菌内毒素是一种由细菌产生的有毒分子，它可以引起中毒反应并对人类健康造成危害。
因此，准确检测和验证细菌内毒素的方法非常重要。
本方案旨在验证细菌内毒素检验方法的准确性和可靠性。
二、实验目的本实验旨在验证细菌内毒素检验方法，确保其能够准确地检测细菌内毒素的含量。
三、实验材料和设备1. 细菌内毒素检验试剂盒2. 细菌培养基3. 细菌菌种4. 培养皿5. 恒温培养箱6. 试管7. 离心机8. 显微镜9. 无菌培养室四、实验步骤1. 准备工作a. 清洁实验桌面和实验器材，防止污染。
b. 准备所需要的材料和设备，并确保其干净和无菌。
2. 细菌培养a. 随机取一支细菌菌种采样放入培养基中并均匀涂抹于培养皿上。
b. 将培养皿置于恒温培养箱中，以适当的温度和时间培养细菌。
3. 细菌内毒素检验a. 取一份细菌内毒素检验试剂盒，根据说明书的指导进行试剂的调配和处理。
b. 等待试剂反应完成后，根据试剂盒的说明书进行结果的解读。
4. 结果分析a. 观察试剂盒结果，根据颜色变化和强度判断细菌内毒素的含量。
b. 结果符合预期的样本被认为是阳性，否则为阴性。
五、质量控制1. 测量前需进行必要的质量控制，包括试剂的稳定性和标准品的准确性。
六、风险控制1. 实验过程中需佩戴个人防护装备，如实验手套和口罩，以减少潜在的健康风险。
七、数据处理与结果1. 将实验所得数据进行整理和统计，并进行数据分析和结果的解读。
八、讨论与结论1. 讨论实验结果与预期结果之间的差异，分析可能的原因，并提出改进和优化的建议。
2. 结论验证细菌内毒素检验方法的准确性和可靠性。
九、参考文献参考实验所使用的细菌内毒素检验方法的相关文献。
以上是细菌内毒素检验方法验证方案的内容，该方案通过详细的步骤和操作说明，确保了实验的准确性和可靠性。
通过验证该方法，将可为细菌内毒素检验提供可靠的数据支持，为相关领域的研究和应用提供技术支持。
中国药典 细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。
首先，制备试样溶液。
将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。
然后，制备标准溶液。
将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。
接下来，准备试管。
将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。
然后，进行混合。
轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。
接着，培养细菌。
将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。
培养结束后，观察结果。
通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。
最后，记录结果。
根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法细菌内毒素是一类由细菌产生的有毒物质，它们可以对人体和动物产生严重的危害。
因此，对细菌内毒素进行及时、准确的检测显得尤为重要。
本文将介绍几种常见的细菌内毒素检测方法，以供参考。
首先，常见的细菌内毒素检测方法之一是生物学检测法。
这种方法利用动物、细胞或其他生物体对内毒素的反应来进行检测。
例如，利用小鼠腹腔注射内毒素，观察其生理反应来判断内毒素的存在与否。
虽然这种方法具有较高的灵敏度和特异性，但由于涉及动物实验，存在一定的道德和法律问题，因此在实际应用中受到一定的限制。
其次，化学检测法也是一种常用的细菌内毒素检测方法。
该方法利用化学试剂与内毒素发生特定反应，通过观察反应产物的形成或颜色变化来判断内毒素的存在与否。
例如，内毒素在特定条件下可与Limulus试剂发生凝集反应，形成凝集物。
这种方法具有操作简便、结果快速的优点，但也存在一定的特异性和灵敏度问题。
另外，免疫学检测法也是一种常见的细菌内毒素检测方法。
该方法利用抗体与内毒素特异性结合，再通过染色、发光等方式来检测结合产物，从而判断内毒素的存在与否。
例如，ELISA法是一种常用的免疫学检测方法，它具有高度的特异性和灵敏度，且可以进行高通量检测，因此在实际应用中得到了广泛的应用。
最后，分子生物学检测法也是一种较为先进的细菌内毒素检测方法。
该方法利用PCR、基因芯片等技术，通过检测内毒素相关基因或基因产物来判断内毒素的存在与否。
这种方法具有高度的特异性和灵敏度，且可以进行多重检测，因此在临床诊断和科研领域得到了广泛的应用。
综上所述，针对细菌内毒素的检测方法有生物学检测法、化学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法等多种选择。
在实际应用中，可以根据需要的特异性、灵敏度、操作简便性等因素来选择合适的检测方法。
希望本文所介绍的内容能够对相关人士有所帮助。
细菌内毒素检查法
三、细菌内毒素检验法
❖ （一）概述
❖ 1.内毒素(Endotoxin)： 即革兰氏阴性菌细胞壁旳脂多糖，其毒性成份为类脂A，菌体死亡崩解后释放 出来。
❖ 2.细菌内毒素检验法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生 旳细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素旳限量是否符合要求旳一种措施。
❖ 3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎旳血液变形细胞溶解物制成旳无菌 冷冻干燥品，具有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活旳凝固酶原，凝固 蛋白原，能够精确、迅速地定性或定量检测样品中是否具有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
❖ 鲎旳图片
鲎旳长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(目前只有化 石)一样古老旳动物。 鲎旳血液中具有铜离子，它旳血液是蓝色旳。这种蓝色血液旳提取物——“鲎试 剂”，能够精确、迅速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品 工业中，可用它对毒素污染进行监测。
s1
s2
阳性对照
阳性产品对照
0.1ml水 0.1ml水
+0.1ml +0.1ml
SMVD1 SMVD1
6
6
0.1ml水 +0.1ml E2入
0.1mlE2入
+0.1ml SMVD16
阴性对照 0.2ml水
❖ （5）封闭管口，摇匀，放入37±1℃旳恒温水浴保温 60±2分钟，取出观察成果，统计成果。
毒素旳措施。(限量、阳性对照、敏捷度、溶剂、稀释倍数） ❖ 内毒素旳量用内毒素单位(EU)表达。 ❖ 该法优点：迅速、敏捷。 ❖ 2.细菌内毒素检验过程中用到旳原则品和试剂 ❖ ①细菌内毒素国标品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到旳内毒素。
中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解
国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
细菌内毒素检验方法验证方案
1 概述：为了符合2010版GMP的要求，为了确保生产检验出符合预定用途和注册要求的产品，确保产品质量合格。
保证用药安全。
确认检查方法的科学持续稳定可靠适用性理想。
本方案对注射用水细菌内毒素检查方法进行验证。
2 验证目的：为确保注射用水细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度在本实验室条件下的适用性保证检测结果科学准确可靠，特制定此方案对注射用水细菌内毒素检查方法进行验证。
3 验证方式：结合实验室实际情况，按照2010版药典附录细菌内毒素检查方法检查。
由合格的检验人员对同一批供试品进行检查同一操作方法同一批供试品检查重复检查3次记录检查结果对比，看检查结果是否符合要求，重复性稳定性是否符合要求。
4 验证范围：适用于注射用水细菌内毒素检查方法验证，按照2010版药典附录细菌内毒素检查方法检查项下要求逐一进行。
5 验证结果的评价：根据药典合格标准来验证确认，确认检查方法检查结果的重现性稳定性是否符合要求。
适用性是否理想。
6 验证机构组成6.1验证委员会根据验证工作需要，常设验证委员会，负责所有验证工作的领导和组织，负责审批验证方案和验证报告、发放验证证书。
验证委员会针对每一个具体验证项目成立专门的验证小组，负责该验证项目的验证方案起草，实施、组织与协调，负责验证结果记录与评定，负责完成验证报告。
6.2验证委员会组成：姓名部门及职务验证委员会中职务验证工作中职责6.4职责：6.4.1 验证委员会：6.4.1.1 负责验证方案的审批。
6.4.1.2 负责验证的总协调工作，以保证本验证方案顺利实施。
6.4.1.3 负责验证数据及结果的审核。
6.4.1.4 负责发放验证证书。
6.4.2 验证小组：6.4.2.1 负责验证方案的制定和实施。
6.4.2.2 负责验证工作的组织与协调。
6.4.2.3 负责验证数据的收集和结果评定。
6.4.2.4 负责完成验证报告。
7文件准备和培训7.1所需文件已准备齐全。
7.2培训：在确认实施前，依据验证小组通过的方案，对参加验证人员培训，明确分工。
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细菌内毒素检测方法验证方案起草人起草日期审核人审核日期批准人批准日期目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容-------------------------------------------------------------------------1.实验材料及用具-------------------------------------------------------2 实验准备----------------------------------------------------------------3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验--------------------------------------------------------------3.3.供试品细菌内毒素检查--------------------------------------------4.验证结论--------------------------------------------------------------附：表1.鲎试剂灵敏度复核记录表2.干扰试验记录表3.细菌内毒素检查记录目的：为确保盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。
范围：盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法责任人：细菌内毒素检验员、QC主管内容：1.实验材料及用具1.1. 电子天平1.2. 电热干燥箱1.3. 恒温水浴箱1.4.水银温度计1.5. 旋涡混合器1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）1.7.细菌内毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品)1.8.细菌内毒素检查用水1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。
2 实验准备2.1. 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。
2.2. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。
达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。
在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
3.具体验证步骤3.1. 鲎试剂灵敏度复核3.1.1. 实验操作3.1.1.1.细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。
3.1.1.2.待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。
每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
3.1.1.3.加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。
4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
3.1.1.4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。
3.1.1.5. 观察并记录结果。
将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）3.1.2. 实验结果计算如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
λc = lg-1 (∑X/4)式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。
反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
3.1.3结果判断3.1.3.1.判断标准当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
3.1.3.2.判断结果：（记录附后）3.2..干扰实验3.2.1. 操作方法3.2.1.1.目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。
使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。
3.2.1.2.制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（方法同3.1.1.1.）。
3.2.2.3.制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将3.2.3.1.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。
3.2.2.4.鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
3.2.2.5.加样将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml 供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。
3.2.3.实验结果计算如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照, 管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(E s)和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(E t).E s= lg-1 (∑X s/4)E t= lg-1 (∑X t/4)X s、X t分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
3.2.4.结果判断3.2.4.1.判断标准当E s在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且E t在0.5 E s～2.0E s （包括0.5 E s和2.0E s）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当E t不在0.5 E s～2.0E s（包括0.5 E s和2.0E s）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。
3.2.4.2.判断结果：（记录附后）。
3.3.供试品细菌内毒素检查在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
3.3.1.操作方法3.3.1.1.供试品溶液的制备：（稀释倍数不得超过MVD）3.3.1.2. 阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同3.1.1.1.）。
3.3.1.3.供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。
（方法同3.2.1.3.2. 供试品阳性对照溶液的制备）。
3.3.1.4.阴性对照液用细菌内毒素检查用水3.3.1.5.鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
3.3.1.6.加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。
3.3.1.7.将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。
保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
3.3.2. 结果判断3.3.2.1.判断标准当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。
若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2 管均为阳性，应认为不符合规定；如2 管中1管为阳性，1 管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。
若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2 管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。