定位克隆
作物基因克隆技术应用进展
基因克隆技术是19世纪70年代初开始发展起来的一项研究技术。
它是研究某一特定基因的表达和功能研究的第一步。
基因克隆技术的发展为作物研究提供了新的技术方法和研究方向。
研究人员利用作物基因克隆技术，通过改变基因型实现了农作物产量、品质、抗性等多种性状的改良，显著提高了农作物的质量。
随着基因克隆技术的不断发展并投入实践应用，关于基因克隆的技术研究也在不断改进。
目前几乎作物研究的每个领域，都有基因克隆技术的身影。
作物基因的克隆技术是作物育种研究的重要组成部分。
主要内容是鉴别分离突变体特异基因并得到完整的基因序列种，进行基因定位，筛选有利性状，最后应用到作物生产实践中。
作物基因克隆技术通常分为两种。
相对比较传统的研究途径的是正向遗传学方式。
反向遗传学途径是新型研究方法，它是先获得遗传基因片段，反向研究基因。
本文主要从几种基因克隆技术的角度出发，来介绍作物基因克隆技术的研究进展，并展望了作物基因克隆技术的发展前景。
1.常用传统基因克隆技术1.1功能克隆功能克隆是出现最早的基因克隆技术之一。
它主要通过研究表达的异常蛋白质，在已知遗传损伤所引起的蛋白质缺陷信息的情况下，进行基因定位并克隆。
步骤的关键是先已知蛋白质，再将其的mRNA反转录成cRNA，然后作为探针，从而从基因组中克隆到所需基因。
更有趣的是，当获得某一个植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守时，也可以通过利用这些已知基因片段，去筛选未知基因库，从而分离出未知新基因。
周兆斓等利用Kond等克隆和测序编码了水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组，之后将其导入甘薯、马铃薯、茄子等多个作物，极大地改善了作物的抗虫能力。
功能克隆是人们在克隆领域摸索出第一种最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。
功能克隆是简单实用的方法，但是它需要已知基因信息才能进行克隆，因此最初应用功能克隆方法的时候，具有很大的局限性。
1.2定位克隆定位克隆又叫图位克隆，是人们研究出的可以克服基因编码序列未知对功能克隆限制性的一种克隆方法。
克隆技术简介
克隆技术介绍张勋学号：160820216摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。
人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。
本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。
一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。
学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。
1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。
在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。
克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。
克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。
时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。
这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。
简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。
但克隆与无性繁殖是不同的。
克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。
植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。
基因分离的策略
基因分离的策略一、概念基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。
分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。
基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。
基因的分离是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。
由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组的很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、C、G四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。
二、基因克隆的总体策略1、功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。
①通过分析蛋白质中氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从cDNA文库中分离cDNA克隆②通过制备基因产物单抗来进行cDNA片段分离③通过构建cDNA的表达文库，利用基因产物的功能来筛选基因2、定位克隆法：在事先不知道基因的相关功能信息的条件下，通过遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体某一区段，再通过该区域的精细物理图或表达图分析、寻找候选基因并进行突变分析从而确定疾病的相关基因。
CpG岛筛选法、NotI连锁片段筛选法、外显子捕捉法和外显子扩增法、剪切位点筛选法、启动子捕捉法、polyA捕捉法、显微切割微克隆法、候选基因法。
3、消减杂交：将不同来源的基因组DNA或mRNA进行杂交，两者之间相同的核酸片段互补，或通过随机引物进行差别显示PCR扩增不同来源的cDNA，比较其中的mRNA表达差异，从而将两种之间的差异mRNA被筛选出来。
该法有两种思路：①采用杂交的方法：消减文库、代表性差异显示、比较基因组错配筛选② mRNA差别显示，采用PCR扩增，比较其mRNA的表达差异。
4、动物园杂交：利用一些基因在进化中高度保守的特点，在同种或不同种生物的基因组中有许多高度同源的基因，或具有共同的结构，因而可以利用已经有的基因与基因组文库或cDNA文库杂交，来调取高度同源、或结构相似、功能相似的基因。
图位克隆-李金伟.
李金伟
2012215423
无论头上是怎样的天空，我准备承受任何风暴。
内容简要
1
图位克隆技术的基本原理 图位克隆的一般步骤（考研）
图位克隆在植物基因分离中的应用 图位克隆的现状和前景
2
3
4
图位克隆技术的基本原理
图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) , 1986 年 首先由剑桥大学的Alancoulson 提出，是近几年 来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展 起来的一种行的基因克隆的一种方法
图位克隆的一般步骤
最为常用的分子 标记
SSLPs
SSLP是基于PCR的分 子标记，检测比较直接 ，只需要通过设计引物 便可检测鉴定的SSLP标 记
SNPs
SNPs标记的检测也比 较直接，它是不同生态 型之间基因组中的单个 核苷酸的差别，这些差 别的核苷酸通常位于不 编码区域，常见的检测 SNPs标记的方法主要是 剪切扩增多态性序பைடு நூலகம்（ CAPS），它是基于PCR的
侧翼分子 标记
混合样 品作图
指在准确鉴定目的基因表型（单基因控制的隐性突变 ）的基础上，把大群体中单株突变体分成若干组，以 组为单位提取DNA，形成一个混合的DNA池进行分析， 根据所有池中分子标记与目的基因发生的重组数来确 定与目的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近 所有分子标记的顺序
图位克隆的一般步骤
图位克隆的一般步骤
2.4目的基因的筛选和鉴定 2.4.1目的基因的筛选
筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环 节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分 子标记所在的大片段克隆后，就可以利用该克隆为探针进行 染色体步移，逐渐靠近目的基因。
家蚕基因定位克隆
突变在U位点在家蚕产生是因为机翼光盘蜕皮激素的压抑响应无翅蛹和蛾。
隐性等位基因发生自发并映射在家蚕遗传连锁群1013.0。
通过定位克隆，我们该负责基因是边缘（FNG）编码FNG糖基转移酶，它参与调节Notch信号通路。
在四个不同的等位基因，我们发现了大量缺失FNG基因k和无义突变中，邻，和n。
在野生型（WT）蚕，FNG积极表现在翼片，脑和生殖器官从第四到NAL龄，但几乎没有在测试的其他组织。
原位杂交结果显示，FNG mRNA在野生翼盘的背层。
在无翅（WG）的mRNA，FNG-介导的Notch信号通路的下游标记，被定位于在WT翼盘背腹边界，但在边路盘明显压抑。
虽然果蝇FNG 的无效突变导致胚后的杀伤力，在家蚕FNG功能丧失只影响翼形态发生，组织分化表明昆虫之间的FNG不同的重要作用.翼的形成是一个重要的形态学变化翅膀的翼成虫盘，以回应昆虫保幼激素，蜕皮激素和。
果蝇的翼盘是一个良好的研究模型系统识别-ING参与模式的形成众多基因和形态理解过程的基因调控。
然而，无论是在果蝇中发现的机制实际上是应用竹叶提取其它昆虫物种还有待。
此外，虽然许多研究显示蜕皮激素对体外培养的翼盘发展的影响，鲜为人知的是，激素介导翼和变态过程中组织分化的分子机制。
翼的突变体中的原因是到涉及''基因的功能丧失。
显然，我们在K翼光盘表达异常的基因，发现膜联蛋白B13（Anxb13）的表达完全。
通过比较野生型和通过使用Anxb13的cDNA 作探针进行杂交ķ的基因组结构，我们发现，在整个基因是从第k基因组丢失。
此外，我们已经发现，Anxb13位于染色体（LG10），其包含的轨迹上。
这些表明，该基因可能位于附近Anxb13。
我们承诺通过定位克隆，以确定该基因，开始在Anxb13基因，细菌染色体（BAC）文库筛选和鸟枪法测序的基础上。
首先，我们比较了在k个突变体与野生型的周围区域的结构。
我们检测到一个大的染色体缺失以k，其中包括Anxb13和其他4个基因。
基因组学-名词解释
基因组学-名词解释Chromosome walking，染色体步移，通过鉴定克隆DNA的重叠部分来构建克隆重叠群的一种方法 Contig，（重叠群）一组连续的重叠DNA序列 C-value paradox，（C值悖论）在每一种生物中其单倍体基因组的DNA总量是特异的，被称为C值 (C Value)。
C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象称为C值悖论 CpG island，（CPG岛）人类基因组中大约56%的基因上游富含GC的DNA区域 Physical gap，（物理间隙）指构建基因组文库时被丢失的DNA序列，它们从已有的克隆群体中永久性地消失Restriction mapping，限制性酶切图谱，通过分析限制性酶切片段的大小确定DNA分子中限制性酶切位点Scaffold,骨架序列，序列间隙分开的一系列序列重叠群Genomics, 基因组学，研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。
用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。
Proteomics, 蛋白质组学，用来研究蛋白质组的各种技术Histone code，组蛋白密码，组蛋白化学修饰的模式影响各种细胞活性的假说 Map-based cloning，又称定位克隆(positional cloning),用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息Restriction fragment length polymorphism (RFLP)，限制性片段长度多态性，因为在其一端或两端存在多态性限制位点而产生的长度各异的限制性片段Epigenetics，表观遗传学，是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科pseudogene, （假基因）一个失活，即无功能性的基因拷贝 nucleoid,（拟核）原核生物中的含DNA区域fluorescent in situ hybriduzation, 荧光原位杂交，一种通过观察荧光标记在染色体的位置而确定标记物的技术sequence tagged site mapping,序列标签位点，基因组中唯一的一段DNA序列mapping reagent,作图试剂，在STS作图中使用的一种分布于单个染色体或整个基因组的DNA片段集合SSLP, 简单序列长度多态图，一系列表现长度多态性的重复序列variable number of tandem repeat, 可变数串联重复，由十几个核苷酸的重复序列拷贝组成的简单序列长度多态图，也叫小卫星short tandem repeat,短序列重复，由二，三或四核甘酸重复单位顺序排列组成的一种简单序列多态性，也叫微卫星long(or short) interspersed nuclear element, 长散布重复片段，一种基因组范围的重复序列，常常具有转座活性RNA world, 进化早期所有生化反应以RNA为中心的时期 genetic mapping, 遗传作图，采用遗传学技术构建基因组图谱physical mapping（物理图）采用分子生物学技术构建基因组图谱的方法感谢您的阅读，祝您生活愉快。
克隆技术简介
克隆技术介绍张勋学号：160820216摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。
人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。
本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。
一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。
学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。
1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。
在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。
克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。
克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。
时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。
这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。
简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。
但克隆与无性繁殖是不同的。
克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。
植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。
文档图位克隆原理及应用
位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。
正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。
3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。
缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。
4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。
BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。
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当前，人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移，一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post-genomics)，也即功能基因组(functional genomics)时代，即将到来。
如何获取基因的功能信息，即与人类重大疾病和重要生理功能相关的基因信息，就摆在了我们面前。
定位候选克隆策略(positional candidate cloning)是传统定位克隆(positional cloning)的改进和发展，并以其在克隆疾病相关基因中的有效性而日益受到重视。
人类基因组计划已确定了一系列分布于全基因组24条染色体上的分子标记。
根据这些分子标记的序列和定位信息，结合杂交或PCR 的方法可以快速检测染色体上与肿瘤或遗传性疾病相关的热点位置，进而从中克隆疾病相关基因。
定位候选克隆克服了经典的定位克隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁冗而缓慢的弊端，大大加快了克隆工作的进程，而且它也不仅仅局限于遗传病，现在已更多地运用于肿瘤易感基因的克隆工作。
1994年国际上开始构建并于1996年首次公布的基因图谱是一个以cDNA为基础的STS(sequence-tagged site)标记的物理图和多态性微卫星标记的遗传图相结合的图谱，它一方面使染色体定位更加准确、可靠、精密，同时为从候选区域内获得疾病相关的候选基因提供了极大的便利，使得目的基因的克隆更加简便而快捷，为这种方法的发展和应用注入了更大的活力，表现为此后相继克隆出16条新的疾病相关基因，如从胰腺癌中分离得到的抑癌基因DPC4等。
1998年10月GeneBank公布了最新的“基因图谱98”，它的信息量更大，且准确度和精确度都有大幅度的提高，包含有41 464个STS标记，代表了30 181条基因的定位信息，也即完成了人的全部基因组约6万～7万条基因中的一半左右的定位工作〔2〕。
总之，随着人类基因组计划的推进，定位候选克隆已成为一种有效的克隆疾病相关基因的方法。
定位候选克隆包括三个基本步骤：基因组定位、候选cDNA的获得、全长及功能分析。
本文即对此策略的发展和应用作一概要介绍。
1.基因组定位
新发展起来的，尤其在分离肿瘤易感基因中常用的方法是用PCR方法检测多样本的杂合性丢失(LOH)或纯合性丢失的高发频率区，从而获得疾病候选基因定位〔3〕。
体细胞抑癌基因的失活是导致癌变的一个主要因素，最常见的表现即杂合性缺失。
通常在染色体上杂合性缺失的高发频率区含有一个或多个抑癌基因。
利用散布于各条染色体上的分子标记(包括STS、微卫星标记等)，用PCR检测多个肿瘤样本的染色体各区带的缺失情况，可确定LOH的高发频率区，也即确定了相关肿瘤生长负调控因子的染色体定位，并可精确到基因组分子标记指示的区域，进一步可作基因的克隆工作。
利用这一方法已成功地克隆了几个抑癌基因，如乳腺癌中的BRCA1、BRCA2及胰腺癌中的DPC4基因等。
同时，FISH技术的不断发展及推广应用，染色体显微切割技术的成熟，可在显微镜下切割特定的染色体区带，制备染色体区带特异探针，对正常和病变组织作FISH分析，比较确定疾病相关基因的染色体区带定位。
近些年来，RH谱(radiation hybrid map)的建立，使染色体精细定位成为可能。
这些方法比原先连锁分析的检测速度更快、精确度更高。
例如L-C Tsui用连锁分析花费了大约10年的时间才把囊性纤维变性基因定位在7号染色体，而现在可能只要一年或更短的时间就可完成这项工作。
2.候选cDNA的筛选
基因组定位提供的信息包含一定的分子标记，可用PCR或杂交的方法直接从YAC(yeast artificial chromosome)库，或从BAC(bacterial artificial chromosome)库、PAC(P1 artificial chromosome)库中筛选相对应的克隆。
YAC库的嵌合性严重且操作难度较大，已逐步为PAC 库和BAC库取代。
PAC系统是以噬菌体P1为基础的克隆系统，它可容纳70～100kb的插入片段，并可选择性地区分重组子和非重组子，且同时有两套复制机制。
单拷贝复制子可用于稳定克隆增殖，而多拷贝复制子则可在Lac操纵子的控制下用于DNA的制备〔4〕。
BAC系统是基于大肠杆菌中可大容量容纳基因且稳定性良好的F因子衍生而来的载体系统，可容纳超过100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均长度为120kb，最大可达到240kb左右〔5〕。
良好的稳定性和操作的简便性是BAC系统的主要优点。
由这些克隆入手，采用依赖于适当cDNA文库的方法、依赖于特征序列的方法或依赖于表达性质等方法获得候选cDNA。
(1) 依赖适当cDNA文库的方法有直接筛选法和cDNA选择法(cDNA selection)。
直接筛选法即用基因组DNA直接从cDNA文库中筛选位于该基因组片段内的cDNA，如从覆盖有候选区域的YAC〔6〕、PAC〔7〕、BAC克隆中分离外源片段作为探针从文库中筛选候选基因；而cDNA选择法〔8〕恰恰与直接筛选法相反，它把基因组DNA固定在膜上，用总cDNA与之杂交，通过PCR从中回收可与基因组片段结合的cDNA片段。
直接筛选法的优点在于避免了对候选区域大片段地亚克隆操作，且在单一的筛选中可以获得多个转录子的信息。
但缺点是大片段地纯化，标记较困难，而PAC、BAC克隆片段纯化相对方便的优点就成为这种方法发展的趋势；同时由于探针的复杂性，使杂交背景加深，假阳性增多，而且容易忽略短的外显子或低丰度cDNA。
cDNA选择法的最大优越性在于PCR反应的介入，大大提高了选择的灵敏度，可以检测到一些稀有转录子。
(2) 依赖特征序列的方法是依据转录子内部及其两侧的序列特征直接从基因组DNA中分离cDNA片段，主要有CpG岛搜寻法、外显子捕获法(exon trapping)、交叉物种序列同源性比较法(cross-species sequence homology)、Alu PCR法与直接序列分析法等。
CpG岛也称为HTF岛，是一些富含GC的小区域。
大部分转录子的附近(通常是在5′上游区域)都含有非甲基化的CpG岛〔9〕。
利用一些识别CpG岛的稀有酶，如SacⅡ、BssHⅡ、EagⅠ等，切割基因组DNA，获得位于CpG岛附近的序列作为探针从总RNA或cDNA文库中得到转录子。
外显子捕获法是基于对外显子两侧的功能性5′和3′剪接位点的识别，从基因组DNA中分离外显子片段〔10〕。
交叉物种序列同源性比较的依据是编码区序列在不同物种间的保守性要远高于非编码区〔11〕，把候选区域的DNA分为多个亚克隆，分别与不同的物种总DNA杂交，与不同物种DNA都有阳性信号的DNA克隆可能就是编码区基因。
这种方法依赖的是物种间DNA水平上的序列同源性。
Alu序列是散布于人基因组中的短的重复序列，通过设计人特异的Alu序列作为引物，可直接快速用PCR方法从YAC、BAC、PAC 克隆或人鼠杂合细胞中得到人源的特异序列〔12〕。
直接序列分析法则在基因组序列信息中用GRAIL和GeneScan等软件分析推测编码基因的方法〔13〕。
(3) 表达依赖法，也即Northern杂交分析法〔14〕。
用候选区域基因组DNA作为探针与总RNA杂交，切下阳性条带，反转录为cDNA 并克隆，即可获得位于此基因组片段中的转录子。
上述方法都各有其优缺点，必须根据原材料及要达到的目的，选择适当的一种或多种方法组合来达到研究目的。
此外，其它方法还很多，如微切割和微克隆法、减法cDNA杂交法、重组筛选法等。
3.全长及功能分析
获得了众多的候选cDNA后，通过筛选cDNA文库或RACE等方法克隆全长基因。
为确定其中的致病基因，需要逐个检测它们在患病家系中的变化情况，并分析其功能。
功能分析往往是定位克隆中的一个难点，因为不同的疾病有不同的特征，也就需要用不同的功能检测系统进行分析。
常用的如细胞水平的正义或反义基因的表达后细胞形态和功能变化的研究，在肿瘤研究中检测细胞形态和接触抑制的变化，软琼脂生长能力的变化及裸鼠致瘤性分析等。
更进一步的功能分析则包括个体水平的基因敲除实验等。
现在还发展出了一些与其它方法相结合的新思路，如与差减杂交相结合，筛选位于候选区域的差异表达基因，大大提高了获得有价值基因的可能性。
同时人类基因组计划中转录图谱〔15〕工作的开展，有很多EST已被精确定位于染色体的不同区带上，可以直接进行功能研究。
随着研究的深入，越来越多的EST定位工作的完成，基因转录图谱的不断完善，我们完全可以直接跳过定位克隆的第二个步骤而直接进入功能鉴定和基因全长的克隆工作，这可能将是定位克隆中最快的方法。
在分析分离手段不断提高，人类基因组计划紧锣密鼓地实施的今天，各种新思路新方法层出不穷，定位克隆方法的周期也将不断缩小，为人类最终克隆各种疾病基因提供了可能性。