植物基因定位与克隆技术
4.植物基因克隆技术进展
1 功能克隆
功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功 能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆 基因的策略。 其基本步骤为：根据已知的生化缺陷或特征确认 与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出 部分氨基酸序列 – 根据遗传密码推测其可能的编码序列，设列 – 或者使用该蛋白质对选中的克隆测序，获得目的基 因的序列
1 功能克隆
关键技术： 用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一 个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或选 • 例如与苯丙酮尿症相关的酪氨酸羟化酶基因， 与镰刀型细胞贫血症相关的珠蛋白基因，都是 用这种方法取得成功例子。
dna代表性差异分析dnarepresentatioaldifferenceanalysisdnarda抑制性消减杂交法suppressionsubtractivehybridizationsshcdnaaflp技术rna指纹技术等目前用这些方法已经相继克隆了许多基因6基因芯片技术genechips?基因芯片又称dna芯片dna微阵列dnamicroarray是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针有规律地排列固定于支持物上然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测从而迅速得出所要的信息
3 转座子标签法
• 随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后， 目前已在拟南芥、番茄、水稻中有广泛的运用。 • 同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测 序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标 签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功 能研究的核心技术。
4 同源序列法
• 同源序列法是根据与待克隆基因同源的已知序列 进行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已 知，当要克隆类似基因时可先从Genbank 库中找 到有关基因序列，设计出特异引物；以植物基因 组DNA 或者cDNA为模板， 采取PCR 或RT-PCR 的方法来扩增目的基因；扩增的片段经纯化后， 连接到合适的载体上，进行序列分析、比较验证 并确认目的基因的克隆。 • 优点：利用PCR 技术，快速、简便。非常大的成 功 • 局限性：依赖于已知的序列
基因工程育种的原理
基因工程育种的原理
基因工程育种是指利用分子生物学和生物技术手段对作物的遗传物质进行改良，以达到提高作物产量、抗病性和适应性的目的。
基因工程育种的原理主要包括基因定位、基因克隆、基因转移和基因表达等几个方面。
首先，基因定位是基因工程育种的第一步。
通过分子标记技术和遗传连锁图谱，可以精确定位到目标基因的位置，确定其在染色体上的具体位置和序列信息。
这为后续的基因克隆和转移奠定了基础。
其次，基因克隆是基因工程育种的关键环节。
通过PCR扩增、限制酶切割和
连接、转化等技术，可以将目标基因从原始植物中精确地克隆出来，并进行进一步的分析和改造。
基因转移是基因工程育种的核心技术之一。
通过载体介导的转基因技术，可以
将目标基因导入到受体植物中，实现外源基因的稳定表达。
这样就可以使受体植物获得目标基因所带来的新性状，比如抗病性、耐逆性、提高产量等。
最后，基因表达是基因工程育种的最终目的。
通过转录、翻译和后转录修饰等
生物学过程，外源基因被转录成mRNA，再翻译成蛋白质，从而表达出新的功能
性状。
这就是基因工程育种实现作物改良的关键步骤。
总的来说，基因工程育种的原理是通过精确定位、克隆、转移和表达目标基因，实现对作物遗传物质的改良和优化，从而获得具有新性状和优良特性的新品种。
这一技术的应用为农业生产提供了新的手段和途径，对于解决粮食安全、提高农业生产效率具有重要意义。
随着生物技术的不断发展和进步，基因工程育种将在未来发挥更加重要的作用，为人类粮食生产和农业可持续发展做出更大的贡献。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
基因的定位克隆
构建遗传图谱 构建物理图谱
M1
M2
染色体步移： Chromos未测序的物种可通过染色体步移的方法进行定位，但是 比较费时费力，而对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成的物 种，则不在利用染色体步移的方法进行定位，直接从构建遗传图谱到 构建物理图谱，最后确定目标基因的候选基因，再通过互补实验进行
亲本型
ec ct
+
++
cv
双交换型
++
+
ec ct cv
ec ct
+
++
cv
ec +
ct
+ cv
+
ct ec
+
++
cv
ec +
+
+ ct
cv
ec cv
ct
++
+
ct +
+
+ ec
cv
3、计算重组值，确定图距
(1)、计算ct—cv的重组值 忽视表中第一列(ec/+)的存在，将它们放在括弧中，比
较第二、三列：
二、三点测交(three-point testcross)与染色体作图
为了进行基因定位，摩尔根和他的学生Sturtevant创造了 三点测交方法，即将3个基因包括在同一次交配中。进行这种 测交，一次实验就等于3次两点试验。
已知在果蝇中棘眼(ec)、截翅(ct)和横脉缺失(cv)这3个隐 性突变基因都是X连锁的。把棘眼、截翅个体与横脉缺失个体
上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的 原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另 一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。
作物基因定位的途径
作物基因定位的途径一、引言作物基因定位是指确定作物基因在染色体上的位置和位置与性状之间的关系。
它是作物遗传学和分子育种的基础，为作物改良提供了重要的理论和技术支持。
本文将从不同角度探讨作物基因定位的途径，并介绍它们的优缺点和应用情况。
二、作物基因定位的途径1.传统遗传学方法•遗传连锁图法：通过分析遗传连锁图，确定染色体上基因的相对位置。
主要方法有三点配子试验法、二点试验法和多点试验法。
•遗传映射法：利用遗传连锁图和群体杂种图，确定基因的绝对位置。
主要方法有连锁不平衡分析和融合连锁分析。
2.分子标记辅助选育方法•RFLP（限制性片段长度多态性）：通过分离、纯化和测定限制性酶切片段，将其与遗传连锁图相结合，实现基因定位。
•SSR（微卫星标记）：通过PCR扩增微卫星DNA片段，检测其在不同位点的长度变异，确定基因位置。
•SNP（单核苷酸多态性）：通过测定基因组中特定位置上的单核苷酸变异，将其与遗传连锁图相结合，实现基因定位。
•AFLP（扩增片段长度多态性）：通过PCR扩增剪切DNA片段，将其与遗传连锁图相结合，实现基因定位。
3.基因组学方法•位置克隆法：将感兴趣的基因从新引入敲除构建中，通过其对敲除的表型进行定位。
•QTL（数量性状位点）定位法：通过连锁分析和基因表达研究，确定数量性状与基因之间的关系。
•基因组关联分析法：通过分析大量群体的基因组序列和表型数据，确定基因组区域与性状相关的位点。
三、作物基因定位的优缺点1.传统遗传学方法的优缺点•优点：简单易行，不需要复杂的实验设备和技术。
•缺点：分辨率较低，需要大量的试验材料和时间。
2.分子标记辅助选育方法的优缺点•优点：高分辨率，可以精确定位基因。
•缺点：成本较高，需要复杂的实验设备和技术。
3.基因组学方法的优缺点•优点：高通量，可以同时分析大量基因和性状。
•缺点：分析结果复杂，需要强大的数据分析能力。
四、作物基因定位的应用情况作物基因定位的途径已经在作物改良中得到了广泛应用。
基因定位与克隆
基因定位 基因克隆
寻找基因的思路：
基因定位 基因克隆 基因分离
克隆目的基因片段 将基因定位于染色体上
e mapping )
基因定位：是指用一定的方法将基因确定到染
色体的实际位置。
Wilson, 1911年首次将红绿色盲基因定位到X
二、体细胞杂交法
体细胞杂交法 也称细胞融合(cell infusion)，是将来源 不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产 生的细胞称杂种细胞(hybrid cell)，含双亲 不同的染色体。
原理
细胞进行融合时，培养液中只有部分细 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。
SSR标记RM169和RM39在Ⅱ-32B/162d F2代半矮秆和矮秆群体中的分离
F2群体 RM169 半矮秆 矮秆 RM39 半矮秆 矮秆 总株数 Ⅱ-32B带型 杂合带型 株数 株数 18 57 20 39 5 15 5 9 9 31 11 22 162d带型 株数 4 11 4 8 理论比 X2 P
混合池的利用：
在实际利用中，两个混合池通常与两个亲本一 起做分子标记的分析。当两个亲本的带型有差异， 而两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的 基因不连锁；当两个亲本的带型有差异，而两个混 合池的带型也有相应的差异时，表明该标记与目的 基因可能存在连锁关系。 通过混合池的利用筛选出可能与目的基因存在 连锁关系的标记后，还要利用整个作图群体做连锁 分析，才能确定它们之间的连锁关系。
plno 1 3 4 5 6 8 9 10 11 13 14 15 16 17 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 34 35 37 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
植物抗病基因同源序列及其在抗病基因克隆与定位中的应用
的入侵 ； 形成 侵填 体 等 结构 来 限制 病 原物 在 体 内 的 扩展 、 蔓延 ； 合成 植 物保 卫 素 来 抑制 、 死 人侵 的病 杀 原菌 ； 诱导产 生 各 种病 程 相关 蛋 白 （ａｈｇｎｓｓｒ一 ｐｔｏｅｅｉ ｅ ［ｅ ｒｔｉ， Ｒ蛋 白 ） ａ ｄｐｏｅ Ｐ ｔ ｎ 如几 丁 质酶 、 葡聚 糖 酶 来 降 解病原 真菌 的细 胞 壁 ； 释放 活性 氧 及 产 生过 敏 性 反 应 （ｙｅｓｎｉｖ ｓｏｔ ， 等 。另 外 ， 物体 内 ｈｐｒ ｓｉｅｒ ｐｒｅＨＲ） ｅ ｔ ｅ ｓ 植 本 身含有 的一些 物 质如单 宁 、 苷 、 苷等 也具有 抗 皂 硫 病 的作用 。其 中 ， 敏 性 反 应 常被 认 为 是 植 物高 度 过 抗病 的一种 表现 ， 由主效基 因所控 制 的一种反应 ， 是 是植 物体 内抗 性基 因 （ｅｉａｃ ｅｅ 产物 与 病 原 ｒｓ ｔ ｅｇｎ ） ｓｎ 物无毒基 因 （ｖｒｌ ｃ ｅｅ 产 物 的强 烈 相 互 作 用 ａｉ ｅ ｅｇｎ ） ｕｎ 的结 果 ， 合 Ｆｏ 提 出的基 因对 基 因假说 （ｅｅｆｒ 符 ｌｒ ｇｎ ｏ
２ｏ ａ ｏ ｌｎ ＆ Ｃ ＆ ￣ ｆＰａ ｔ ＆ Ｔｃ ￣ｌ ｙＨｕ ａ ｇ ｉ ｌｕａ ｅｆ ｏ ｉ ｇ ｎ ｎＡ ｒｃ ｔｒｌＵｎｖｒｄ ．Ｃ ａ ｇ ｒ １１８） ｕ ｉｅｓｙ ｈ ｎａａ ４ ０ ２ ，
Ａｉ ｔ ｃ ： Ｍｏ ｅｔ ａ ０ ｐａ ｔｒｓ ｔａｅｇ ｎ ｓ ａ ｅｈ ｎｉ ｌ￣ ｄａ ｄｓｑ ｅ ｃｄｉ ｈ ｓ ｅａ ｅ ￣ ｒ ｌ ａ ｒ ｈｎ ２ ｌ ｅ￣ ｍ ｃ ｅ ｅ ｖ ｅ ｒｃｏ ｅ ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ ｔｅｌ ｔｄ ｃｄ Ｐｒｔ ｎ ｎ ｏ ｅ ｎ ｓ ｈ ｎ ａ ｏ ｅ ｓｅ ｃｄ ｄ ｉ
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
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植物基因定位与克隆技术
生命的基因组是由数以亿计的基因所组成，而每一个基因都拥
有着许多重要的生物学功能。
在植物研究领域，基因定位与克隆
技术被广泛应用于植物基因的分离、克隆和功能研究中，为科学
家们提供了更深入的了解植物多样性和生命过程的机会。
植物基因定位技术是通过分析遗传连锁相连的遗传标记与感兴
趣的基因间的关系来确定基因位置的一种方法。
这些遗传标记可
以是单核苷酸多态性（SNP）、限制性片段长度多态性（RFLP）
或微卫星标记（SSR）等。
定位分析过程需要建立一个遗传连锁图谱，并将基因的位置分配到该图谱中。
随着遗传标记和图谱的不
断发展，越来越多的植物基因得以定位，这使得研究人员可以轻
松地实现植物基因的图谱定位和深入研究。
植物克隆技术是一种通过DNA插入和选择筛选，使不含目标DNA片段的细菌自杀，从而获得含有目标基因DNA的单个细菌
克隆的技术。
该技术的基本步骤包括DNA片段的制备、载体选择、DNA插入、转化和筛选。
利用克隆技术，科学家可以克隆任何感
兴趣的植物基因，并进行进一步研究。
利用克隆技术，科学家们
已经成功地枚举出了许多重要的植物基因。
植物基因定位和克隆技术的应用在植物育种和基因工程方面有着重要的地位。
研究植物基因定位可以提供植物多样性和特性的基本知识，帮助育种者选择最佳配对植物，促进多样性和适应性的提高。
另外，克隆技术提供了一个强有力的技术平台，使得研究者可以研究和使用各种巨大优势植物（比如转基因植物）来进行研究和创造。
植物基因定位和克隆技术在植物科学研究和开发中扮演着重要角色。
促进这些技术的进一步发展，将有助于进一步加强植物多样性、新型植物品种的开发和农业的发展。
我相信，我们只有更深入、更全面地了解植物基因定位与克隆技术的原理和应用，才能更好地掌握和运用这些技术。