生物化学检验常用分析技术共34页文档
生物化学检验常用分析技术
待测管 2 待测管 1 标准管 试剂空白管
物质颜色和吸收光颜色的关系
物质颜色
黄绿 黄 橙 红
紫红 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
吸
颜
色
紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 绿 红
收 波
光 长(nm)
400 ~ 450 450 ~ 480 480 ~ 490 490 ~ 500 500 ~ 560 560 ~ 580 580 ~ 600 600 ~ 650 650 ~ 750
Lambert-Beer定律要求条件 • 1、入射光必须是单色光 • 2、被测样品必须是均匀介质 • 3、吸收过程中，吸收物质之间不发生相互作用
4、Lambert-Beer定律的偏离现象
• 1. 吸收定律本身的局限性 • L-B 定律是一个有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。 • 2、仪器因素(非单色光的影响) • 3、化学因素 • 溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发
最大吸收波长
吸 光 度
波长范围
0.80
Ax 0.60
0.40
0.20
0.00
cx
0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
（二）原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸 气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。 即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。 常用的定量方法有： 标准曲线法、标准加入法、内标法。
如果溶液浓度以质量体积比表示时，此常数称为比吸光系数（ ），它 表示当溶液浓度为1g/L、液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度 值。摩尔吸光系数ε和比吸光系数 可相互换算。
生物化学分析方法(整理版)
生物化学分析方法(整理版)1. 简介生物化学分析方法是一种用于研究生物体内化学成分和生物代谢过程的科学技术。
通过分析生物体内的分子、细胞和组织的化学成分和反应，可以深入了解生物体的功能和代谢状态。
本文将介绍几种常用的生物化学分析方法。
2. 分光光度法分光光度法是一种通过测量样品溶液吸光度的方法来确定物质浓度的技术。
它利用样品对特定波长的光的吸收特性来分析样品中的物质含量。
该方法广泛应用于生物化学领域，可用于测定蛋白质、核酸和酶的浓度。
3. 色谱法色谱法是一种用于将混合物中的组分分离和鉴定的方法。
它基于不同组分在固定吸附剂或移动相中的分配行为而实现分离。
在生物化学分析中，常用的色谱法包括气相色谱法和液相色谱法。
这些方法可以用于分离和测定脂质、氨基酸和维生素等生物化学分子。
4. 质谱法质谱法是一种通过测量物质的质量谱图来确定其化学成分和结构的方法。
它将样品转化为气体相或溶液相，并通过离子化和分离来分析样品中的组分。
质谱法在生物化学分析中广泛应用于鉴定和定量蛋白质、代谢产物和药物等分子。
5. 核磁共振法核磁共振法是一种通过测量核自旋对外加磁场的响应来分析样品的方法。
它利用核自旋在外加磁场中的共振吸收特性来确定样品中的化学成分和结构。
核磁共振法可以用于鉴定分子的结构、研究分子间的相互作用，并在生物化学分析中应用于蛋白质和核酸的结构研究。
6. 微量分析法微量分析法是一种用于测定生物样品中微量物质含量的方法。
它包括原子吸收光谱法、荧光光谱法和电化学分析法等。
这些方法具有高灵敏度和高选择性，可用于测定生物体内微量元素、代谢产物和药物等的含量。
7. 结论生物化学分析方法在生物研究和临床诊断中具有重要意义。
通过合理选择合适的分析方法，可以准确测定生物样品中的化学成分和结构，提供有价值的信息用于研究和应用。
以上介绍的几种常用的生物化学分析方法只是其中的一部分，随着科学技术的发展，将会有更多更先进的方法应用于生物化学分析领域。
常用临床生物化学检验技术
5
500 0.42 250000 210
合计 1500 1.32
477
平均 300
550000 0.264
b
Σxy Σx 2
Σ xn· Σ y （Σnx）2
477
1500· 1.32 5
550000
（1500）2 5
0.00081
X为ALT单位,Y为吸光度
b
Σxy
Σx 2
Σ xn· Σ y （Σnx）2
射频区
• 波长 0.1～100cm
微波
• 波长 760～1000nm 远红外射线
• 波长 400～760nm
可见光
• 波长 200～400nm
紫外光
• 波长 10～200nm
远紫外光
• 波长 10-３～10nm
x射线
• 波长 5×10-3～0.14nm γ射线
二、波长与颜色
不同波长光线的颜色
光的波长（nm） 颜 色
第四章 常用临床生物化学检验技术
临床生化检验教研室 李 艳
常用临床生物化学检验技术
• 光谱分析技术: 最基本和最常用 • 电化学分析技术 • 电泳分析技术 • 层析和离心分析技术 • 自动化分析技术
教学目的和要求
掌握：分光光度技术的基本原理及定性和定量方法 自动生化分析仪的工作原理及参数设置
熟悉: 分光光度计的的基本结构 操作方法光源检查和波长校正 离心机相对离心力公式
20×30cm2比例坐标纸， • 浓度全距占多少格，A的全距也应占多
少格 • 空白A等于0，则绘出的曲线通过原点，
成45o角的直线，若曲线大于或小于45o 都不能准确
②样品浓度的选择
• 一般包括待测样品的可能变异的最高值与最 低值。例如血LDH比色法测定，正常波动范 围在190~437金氏单位，疾病时可能低至190 金氏单位，高至750金氏单位，所以标准曲线 浓度应从125~1000金氏单位
临床生物化学检验：第5章 临床生物化学常用分析技术
12
校准曲线示意图
13
吸光系数法
• 根据 A=k*b*c,求c。 如NADH：260nm时的ε为15 000 L/mol/cm; 340nm时的ε为 6 220 L/mol/cm。
2
主要内容
• 第一节 光谱分析技术 • 第二节 层析技术 • 第三节 免疫化学分析技术 • 第四节 质谱分析技术
3
临床生物化学检验常用分析技术
• 光谱分析技术 • 离心技术 • 电泳技术 • 电化学分析技术 • 层析分析技术 • 免疫化学分析技术 • 质谱分析技术 • 核磁共振分析技术
4
第一节 光谱分析技术 （spectral analysis technology）
30
• （2）离子交换层析
• 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力 的离子基团键合在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发 生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。
31
• （3）吸附层析 • 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同
• 优点：消除样品基质效应的影响。
22
二、发射光谱分析法
• 发射光谱：emission spectrum 线状光谱（原子或离子）：元素的固有特征—理论基础 带状光谱（分子） 连续光谱（炙热的固体或液体）
• 发射光谱分析法：emission spectroscopy，ES 根据每种元素特有的线状光谱来识别或检测各种元素。
临床生物化学检验-第5章 常用分析技术
(affinity chromatography)
19
离子交换层析 (ion exchange chromatography, IEC)：是依据各种离子或离子 化合物与固定相离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的方法。
色谱技术 ，发现了液-液即分配色谱法
固定相-
流动相-
20世纪60年代高效液相色谱，high performance liquid chromatography即HPLC
16
1. 按流动相种类分类
气相层析
液相层析
超临界流体 层析 电层析
气体
液体
超临界流体 缓冲溶液、 电场
挥发性有机物
可以溶于水或 有机溶剂中的 各种物资
20
高效液相层析法 (high performance liquid chromatography，HPLC)： 是在经 典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。 由于高效固定相填料颗粒小而 均匀（1.7~10μm） ，会引起高阻力（小颗粒具有高柱效），因此采用高压输液泵输送 流动相 ，可大大加快分析速度 ，故又称高压液相层析法。
临床应用：作为参考方法测定钙、镁定值或建立新常规方法作比较试验。 优点： 灵敏度高、选择性好、分析速度快。 缺点：需校准物、分析条件要求高、操作较复杂、测定每一种元素需特 定的空心阴极灯、有些反应的显色剂本身的颜色会影响测定的专一性。
8
1. 校准曲线法：以校准物浓度（系列浓度）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线 ，在相同条件 下测定待测样品 ，然后在标准曲线上查找待测物质浓度。影响因素较多 ，每次需绘制新标准曲线。
生化检验专科第三章临床生物化学检验常用技术
吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
5
一、吸收光谱分析法
吸收光谱：物质由基态跃迁至激发态时，对辐 射能选择性吸收而得到的原子或分子光谱。
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射， 分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁
32
离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE） 是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子 活度的一种电化学分析法。
33
1.离子选择电极（ISE）的基本结构 离子选择电极
电极腔体
内参比 电极
内参比 溶液
敏感膜
特点：仅对溶液中特定离子有选择性响应。 34
2. 电极电位 膜内外被测离子活度的不同而产生电位差。
（3）其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分
析等方法。
20
二、发射光谱分析法
发射光谱：分子、原子或离子在辐射能作用下，由
基态或低能级态跃迁到激发态，当返回基态或低能级
态时，以辐射形式释放能量，产生的光谱为发射光谱。
包括：原子发射光谱、原子或分子荧光光谱、分子磷
光光谱等。
M * 发光释放能量 M h 发射光谱
7
（一）分光光度法的基本原理 利用物质对光的 吸收作用对物质进行定性或定量分析。
1. 吸光度与透光度
当光线通过溶液时，一部分光被散射；
一部份光被吸收；
另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光 度，表示透过光强度与入射光强度的比值即：
T = I/I0
常用生物化学检验技术_百替生物
第五章 常用生物化学检验技术临床生化检验常用的分析技术有光谱分析技术、电化学分析技术、电泳分析技术、层析和离心分析技术及自动化分析技术。
其中光谱分析技术是最基本和最常用的技术，它具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。
第一节 光谱分析技术光谱技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法，因不同分子的原子团和原子，其发射光谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系。
因此可对物质进行定性和定量分析，此类技术称为光谱技术。
是一种最常用的生化检验测定技术，它主要包括吸收光谱（可见紫外、红外原子吸收光谱法）、发射光谱（荧光法、火焰发射光谱法）和散射光谱（比浊法）。
光是一种高速传播的电磁辐射，具有波、粒二象性，光的波长（λ）的常用单位纳米（nm ），可见光波长400～760nm ，＜400nm 称为紫外光，＞760nm 称为红外光，波长愈短，能量愈大。
可见，紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激发态，这种因物质分子对辐射的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱。
处于高能态的分子（激发态分子）是不稳定的，当返回基态时，便发射出相应的光谱，称为发射光谱。
可见，紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光的吸收定律，即Lambert-Beer 是律，它是吸收光谱法的基本定律。
一、分光光度法的基本原理（一）吸光度与透光度当光线通过均匀、透明的溶液时，一部分光被散射，一部分光被吸收，另一部分光透过溶液。
设入射光强度为Io ，透射光强度为It ，It 与Io 之比称为透光度（T ），即IoIt =T ）透光度（T 常用百分数表示（T%），也称为百分透光度。
透光度的负对数称为吸光度（A ），又称为消光度（E ），光密度（OD ），即It Io lg =IoIt lg －=T lg －=A 吸光度与透光度的换算：T lg －100lg =T1lg=T lg －=A 如透光度=10％时 A = lg100－lg10 = 2－1 = 1透光度=20％时A = lg100－lg20 = 2－1.3 = 0.7（二）Lambert-Beer 定律1. Lambert 定律 当一束强度为Io 的单色光透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，则透过的光线为It 。
生物化学检验常用技术
离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极； 能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出 这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。
33
离子选择性电极的分析方法
1、直接法： 样品不经稀释，直接由电极测量离子活度。
①标准曲线法
用测定离子的纯物质配制一系列已知活度或浓度的标准溶液，用离子计测定， 绘制电极电位与活度对数的关系曲线；然后在相同条件下测定样品，由标准 曲线查得浓度。
②标准比较法 ③标准加入法
将已知的小体积标准溶液，加入已知较大体积的待测液中，根据加入前后电 位值变化，求得待测液中被测离子得浓度。
当化合物含量太少,一般分析方法灵敏度不够时,使用荧光分析技术就能解决测定问题。
18
三、散射光谱分析法
光的散射
用单色光照射透明溶液时，大部分按原来 方向透射，而一小部分则按不同的角度散
射开来。
散射光谱分析法
利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。
透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应的原理一样，只是检测的 光信号与仪器的检测器有区别。 1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所 有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检 测的周期较长。 2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪 器，试剂价格高。
T = I/I0
T×100%为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光 度即：