常用生物化学检验技术课程

结构： 五大部份
光源
单色器
比色杯
检测器
显示器
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（一）光源 光源定义：
指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光 源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良 好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的 变化。
光源种类：
可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用氢灯作为光源。
（五）显示器
是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 13 装置。
三、分光光度计的操作方法
（一）分光光度计的基本操作 以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：
1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。 2.将波长旋至测定的波长。 3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。 4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上 比色池盖子，调节T为100.0。 5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 6.重复步骤4和5 7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）
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（二）单色器 定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。 种类：
滤光片
棱镜
光栅
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（三）比色杯
又称为吸收池或比色皿
材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成
（四）检测器
检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。
（二）原子吸收分光光度法
1．基本原理 2．组成 3．原子吸收分光光度法的特点
（三）荧光光度分析法
1．基本原理 2．影响荧光强度的因素
3．荧光光度定量分析法
4 ．荧光光度分析技术的应用
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（二）吸光度的校正
铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸 光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的 0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长 下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进 行比较，可检测仪器吸光度的准确度。
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四、分光光度技术的定性和定量方法
（一）分光光度技术的定性方法
发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光
度法和红外光谱法
散射光谱分析技术：比浊法
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一、分光光度技术的基本原理
（一）吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分 光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射 光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：
T = I/I0
T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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（二）Lambert-Beer定律
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为：
定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε 1.最大吸收波长λmax方法
2.摩尔消光系数ε方法
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（二）分光光度技术的定量方法
1.标准曲线法
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范 围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准 品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标 本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度， 以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最 小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的 直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光 度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。
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制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制。 （2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。 （3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。 （4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。
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2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
Cu=(Au×Cs)/As
其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近。
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3．其它分析方法
包括差示法、多组份混合物分析和利用 摩尔吸光系数分析等方法。
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五、其它光谱分析技术
（一）火焰光度法
1．基本原理 2．组成
3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中 的应用。
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第一节
光谱分析技术
分光光度技术的基本原理 分光光度计的基本结构 分光光度计的操作方法
分光光度技术的定性和定量方法
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光谱分析技术原理：
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特 征，以此来确定物质性质、结构或含量。
光谱分析技术分类：
A = KLC
（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）
式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度
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据Lambert-Beer定律，当液层厚度为 cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为 摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层 厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波 长下的吸光度值。ε是eer定律的因素 应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 和化学两方面的因素。
1．光学因素：
要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。 2．化学因素：
浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。
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二、分光光度计的基本结构
最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计
第五章
常用生物化学检验技术
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本章内容概要
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 光谱分析技术 电化学分析 电泳技术 层析技术 离心技术 自动生化分析技术
只讲第一节，其它内容在《临床检验 仪器学》中讲授。
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教学目标和要求
1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。 2、熟悉分光光度计的的基本结构和操作方法光源检查 和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的 因素