食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定
高效液相色谱法测定特殊膳食中的烟酸和烟酰胺
高效液相色谱法测定特殊膳食中的烟酸和烟酰胺李 越，方亚莉（山西省食品药品检验所，山西太原 030031）摘 要：目的：建立HPLC法测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法。
方法：采用热水提取，酸性沉淀蛋白质后，以C18色谱柱分离，紫外检测器定量。
结果：烟酸和烟酰胺在0.00～8.00 µg/mL范围内均线性良好，定量限分别为0.9 mg/kg、1.2 mg/kg，回收率为91%～102%，RSD均小于20%。
结论：该方法适用于对特殊膳食中的烟酸和烟酰胺准确、快速的检测。
关键词：特殊膳食；烟酸和烟酰胺；高效液相色谱法烟酰胺与烟酸统称为维生素PP，主要存在于动物内脏、肌肉组织中，水果、蛋黄中也有微量存在，在酵母、米糠、麦麸和肉类中含量丰富，是人体必需的13种维生素之一。
烟酰胺在体内与核糖、磷酸、腺嘌呤构成辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ，它们是许多脱氢酶的辅酶，在体内生物氧化中起脱氢和加氢作用，与很多代谢过程包括葡萄糖酵解、脂肪代谢、丙酮酸代谢和高能磷酸键的生成等有密切关系。
烟酸在体内转化为烟酰胺才能发挥上述作用。
此外烟酸还有较强的外周血管扩张作用[1]。
人体内烟酸不足时会影响糖的酵解、柠檬酸循环、呼吸链以及脂肪酸的生物合成，从而引起烟酸缺乏症。
目前，烟酸和烟酰胺的检测方法主要有微生物法[2]、高效液相色谱法[3]。
微生物法需在无菌条件下操作，成本较高，检验周期长，过程较复杂[4]。
本研究结合实验室现有设施条件，参照GB 5009.89—2016[5]中高效液相色谱法，选择特殊医学用途配方食品作为试验材料，建立了HPLC测定特殊膳食中烟酸和烟酰胺的方法。
1 材料与方法1.1 材料与试剂某品牌均衡型全营养配方粉；烟酸（来源：中国食品药品检定研究院，含量：99.9%）；烟酰胺（来源：SUPELCO，含量：99.9%）；盐酸；氢氧化钠；甲醇（色谱纯）；异丙醇（色谱纯）；庚烷磺酸钠（优级纯）；高氯酸（体积分数为60%）；实验用水为一级超纯水。
食品中烟酸(维生素PP)的测定(NO2)
食品中烟酸(维生素PP)的测定一、概述•烟酸又名维生素PP、尼克酸、抗癞皮病因子等，属水溶性维生素，是具有生物化学活性的吡啶-3-羟酸及其衍生物的总称•烟酸和维生素B1、维生素B2一起参与碳水化合物和能量的代谢、促进血液循环及皮肤健康、维持正常神经系统，也是合成性激素不可或缺的物质•自然界中的烟酸广泛存在于食物中，植物性食物中存在的主要形式为烟酸，动物性食物中主要以烟酰胺形式存在烟酸的化学式为C6H5NO2，相对分子质量为123.11，化学名称为吡啶-3-羟酸(3-pyridinecarboxylicacid)，结构式如下一、概述•烟酸为无色针状晶体，味苦。
性质比较稳定，在酸、碱、氧、光或加热条件下不易破坏，烟酸溶于水，溶于乙醇，但不溶于乙醚。
紫外扫描于198 nm、263 nm处有两个特征波长，其中最大紫外吸收波长为263 nm。
•目前尚未见到因食源烟酸摄入过多而引起中毒的报告，所见烟酸的毒副作用大多为临床大剂量使用烟酸所致。
当口服剂量为30 mg/d～1000 mg/d，有人出现血管扩张的症状；当口服剂量达到3 g/d～9 g/d时，可引起黄疸和血清转氨酶升高，但作用机制尚不十分清楚。
•目前大多数国家制定烟酸膳食参考摄入量为13 mg/d～20 mg/d。
我国推荐的膳食摄入量为男性14 mg/d，女性13 mg/d，和美国一致二、食品中烟酸的测定【说明1】(GB/T 5009.89-2003)微生物法【说明1】•标准方法的来源：• 1．本标准根据全国卫生标准技术委员会“第七个五年计划期间卫生标准研制计划第四项食品卫生标准中理化检验方法制标任务”，由原中国预防医学科学院营养与食品卫生研究负责建立并起草，内蒙古自治区卫生防疫站、青岛医学院等多家科研单位组成协作组反复验证后提出的。
• 2．本法主要是在参照AOAC 944.13以及美国《维生素分析方法》等文献的基础上建立的，适用于所有食品的分析1范围【说明2]•本标准规定了用微生物方法测定食品中的烟酸含量。
微生物法测定食品中的烟酸和烟酰胺
微生物法测定食品中的烟酸和烟酰胺
殷晓红;杨金宝;刘波;王淼
【期刊名称】《中国乳品工业》
【年(卷),期】2003(031)002
【摘要】植物乳杆菌ATCCR8014对烟酸有很高的灵敏性,利用这种特异性,可以定量地测出食品中的烟酸含量.为了达到定量测定的目的,在供繁殖试验菌株所用培养基中供给除烟酸以外的所有营养成分,这样植物乳杆菌的生长就会同标准溶液及未知测定溶液中的烟酸水平相对应,与不同浓度标准溶液的系列吸光度读数对应于各管中所含标准物质的量绘制的标准曲线相比,可以计算出样品中烟酸的含量.
【总页数】4页(P32-35)
【作者】殷晓红;杨金宝;刘波;王淼
【作者单位】国家乳制品质量监督检验中心,黑龙江,哈尔滨,150086;国家乳制品质量监督检验中心,黑龙江,哈尔滨,150086;国家乳制品质量监督检验中心,黑龙江,哈尔滨,150086;国家乳制品质量监督检验中心,黑龙江,哈尔滨,150086
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.7
【相关文献】
1.微生物法测定食品中的烟酰胺 [J], 陈亚波;周敏;杨彤
2.微生物法测定食品中的烟酸和烟酰胺 [J],
3.微生物法测定食品中烟酸和烟酰胺 [J], 周思渝
4.微生物法测定食品中烟酸和烟酰胺 [J], 周思渝
5.高效液相色谱法与微生物法测定食品中烟酸的比较 [J], 袁硕
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婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定
婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定一、方法提要烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程。
它能促进消化系统的健康，减轻胃肠障碍；减轻腹泻现象；使皮肤更健康；使人体能充分地利用食物来增加能量；它是婴幼儿不可缺少的维生素之一。
本实验根据《食品安全国家标准—婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定》中提供的方法进行分析测定。
试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后，以C18色谱柱分离，用紫外检测器定量。
二、试剂及标准溶液配制2.1试剂淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
盐酸（分析纯）。
氢氧化钠（分析纯）。
盐酸(2.4mol/L)：准确移取10mL盐酸于50mL容量瓶中，用水定容。
氢氧化钠溶液（2.5mol/L）：称取 5.0g氢氧化钠于50mL容量瓶中，用水定容。
高氯酸（HClO4）：体积分数为60%。
甲醇（CH4O）：色谱纯。
异丙醇(C3H8O)：色谱纯。
庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S)：优级纯。
2.2标准溶液配制2.2.1烟酸及烟酰胺标准储备液（1.0mg/mL）：称取烟酸及烟酰胺标准品各0.1 g（精确到0.0001g），分别置于100mL容量瓶中，用水溶解定容。
2.2.2烟酸及烟酰胺混合标准中间液（40µg/mL）：分别准确吸取烟酸及烟酰胺标准储备液2mL至50mL定量瓶中，用水定容。
临用前配制。
2.2.3烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液：分别准确吸取烟酸及烟酰胺混合标准中间液1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL，至50mL容量瓶中用水定容。
该标准系列浓度分别为0.80µg/mL、1.60µg/mL、4.00µg/mL、8.00µg/mL。
临用前配制。
三、仪器及工作条件3.1仪器高效液相色谱仪，带紫外检测器（北东西分析仪器有限公司）。
pH计：精度为0.01。
超声波振荡器。
天平：感量为0.1mg。
保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定(NO2)
保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定一、概述•1．盐酸硫胺素•盐酸硫胺素( thiamine，vitamin B1)也叫维生素B1，主要用于防治缺乏维生素B1所致的脚气病，也用于神经炎、心肌炎、消化不良辅助治疗。
甲状腺机能亢进患者，妊娠或高热患者，可适当补充维生素B1，以改善症状•本品还具有维持心脏、神经及消化系统的正常功能，促进碳水化合物在人体内的代谢作用，谷物是盐酸硫胺素主要来源，杂粮、豆类、干酵母、硬果、动物内脏、蛋类、瘦肉也含有较多盐酸硫胺素一、概述•盐酸硫胺素的化学式为C12H17ClN4OS·HCl，相对分子质量为337.27，化学名称为氯化4-甲基-3-[（2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基）甲基]-5-(2-羟基乙基)噻唑鎓盐酸盐，CA名称及编号为4-methyl-3-[(2-methyl-4-amino-5-pyrrmidinyl) methyl]-5-( 2-hydroxyethyl) thiazolium chloride，67-03-8，结构式如下盐酸硫胺素为白色结晶或结晶性粉末，有微弱的特殊臭味，味苦，干燥品在空气中迅即吸收约4%的水分。
在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。
气味似酵母，在酸性溶液中比较稳定，加热不易分解。
但在碱性溶液中极不稳定，紫外线可使其降解而失活，铜离子可加快它的破坏一、概述•盐酸硫胺素过量中毒事件很少见，超过推荐摄入量( RNI) 100倍以上的剂量有可能出现头痛、惊厥、心律失常等。
•盐酸硫胺素与碳水化合物代谢密切相关，其供给量与机体能量总摄入量成正比中国居民维生素B1推荐摄入量(RNI)年龄/岁男性/( mg/d) 女性/(mg/d) 年龄/岁男性/(mg/d)女性/(mg/d) 0～0.2适宜摄入量(AI)0.2适宜摄入量( AI)11～ 1.2 1.20.5～0.3适宜摄入量(AI)0.3适宜摄入量(AI)14～ 1.5 1.21～0.6 0.6 18～ 1.4 1.34～0.7 0.7 孕妇- 1.57～0.9 0.9 乳母- 1.8盐酸硫胺素的可耐受最高摄入量(UL)为50 mg/d。
食品安全国家标准食品烟酸和烟酰胺的测定（编制说明）
食品安全国家标准食品烟酸和烟酰胺的测定（编制说明）《食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》（征求意见稿）编制说明一、标准起草的基本情况根据卫计委《2010年食品安全国家标准清理完善工作安排》（卫办监督函[2010]607号）的要求，本标准受国家卫计委食品安全标准与监测评估司和食品安全国家标准审评委员会的委托，编制组承担了《食品中烟酸的测定》（GB/T5009.89-2003）国家标准的修订工作。
该标准从2014年6月开始制订，2015年3月完成编制和实验室内验证工作，2015年5月完成实验室间验证工作。
接到标准整合任务后，国家乳制品质量监督检验中心针对整合食品安全国家标准《食品中烟酸的测定》的具体工作要求组织了标准起草小组，专门组织技术人员成立研究工作组，通过各种途径查阅收集了大量相关技术资料，收集整理现行食品中烟酸的测定方法，以《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》（GB 14880-2012）为基础，根据原有的研究成果，制定了开展研究的技术路线。
拟定了标准初稿和编制说明框架，工作组根据相关方面意见和实验室内验证结果，对标准初稿进行了修改和完善，在此基础上，形成标准征求意见稿。
本标准的编制遵循GB/T 1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T 20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求进行编制。
本标准是根据国卫办食品函〔2014〕386号《国家卫生计生委办公厅关于印发食品安全国家标准整合工作方案的通知》要求，以《食品中烟酸的测定》（GB/T 5009.89—2003）为基础，对现有国内外方法进行总结和整理，比较了各方法的原理、适用范围和技术参数；将《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品种烟酸和烟酰胺的测定》（GB 5413.15-2010）、《肉与肉制品维生素PP含量测定》（GB/T 9695.25-2008）等2项标准统一整合并修订为新的标准。
烟酰胺的含量测定方法
烟酰胺的含量测定方法烟酰胺的含量测定方法烟酰胺的含量测定方法摘要：本文通过外标法用来检测烟酰胺含量值,并且在此条件下能够检测烟酰胺的最后的含量值是比较可靠的,基于此烟酰胺和烟酸得可以更好的分离,使之具有准确可靠,专属性强,稳定简便等系列特点。
关键词：外标法烟酰胺含量值一、仪器与材料1.仪器Kromasil C18色谱柱，Agilent LC1100高效液相色谱仪,; Hypersil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm); ,CP225D电子天平,SHIMADZU UV2450紫外-可见分光光度计。
2.材料烟酰胺对照品;烟酰胺;磷酸二氢钾,分甲醇,乙腈,色谱纯。
二、方法与结果1.色谱条件采用Agilent 110型高效液相色谱仪,Kro-masil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:磷酸二氢钾溶液(0.01mol.L-1)-水-甲醇-乙腈(1/79/15/5);流速0.8 mL.min-1;柱温:20.0℃检测波长:262nm;进样量:10μL。
柱温:室温。
2.测定方法量测定:精密称取本品约10mg,置100mL量瓶中,加水适量,振摇使溶解,用水稀释至刻度,摇匀,做为供试品溶液(100μg.L-1),精密量取10μL,照2.1项下的色谱条件,注入液相色谱仪,另取烟酰胺对照品适量,加水溶解并稀释制成含烟酰胺100μg.L-1的对照品溶液,同法测定。
按外标法以峰面积计算含量。
3.线性试验3.1精密称取烟酰胺对照品0.04055g置100mL量瓶中,加水溶解并稀释成含烟酰胺405.5μg.mL-1的浓对照品溶液,并稀释成2.028～405.5μg.mL-1的6个浓度的溶液(精密吸取浓对照品溶液1mL,分别置200mL、100mL、50mL、25mL量瓶中;精密吸取3mL、5mL,分别置25mL量瓶中,分别加水稀释至刻度),另取浓对照品溶液,形成7个浓度的溶液,照2.1项下的色谱条件进样10μL ,以峰面积Y对浓度X(μg.L-1)作线性回归,结果:在2.028～405.5μg.mL-1浓度范围内,测得的峰面积与与烟酰胺溶液的浓度呈良好的线性关系:Y=19.76X+3.565,r=0.9999。
乳饮料中烟酸和烟酰胺的液相色谱检测方法
乳饮料中烟酸和烟酰胺的液相色谱检测方法作者：孙伟来源：《中外食品工业》2015年第02期摘要：乳饮料作为当代食品行业中的重要产物，它在人们日常的饮食结构中，所占据的比例也是比较大的。
于是，为了确保乳饮料的质量及其安全性，我们就应当采取液相色谱检测法，对乳饮料中含有的烟酸和烟酰胺进行科学的检测。
因此，本文将针对乳饮料中的烟酸和烟酰胺，对其的液相色谱检测法进行深入的分析和探究。
关键词：烟酸乳饮料液相色谱仪烟酰胺中图分类号：TS275.4 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）04-0043-011 简析烟酸与烟酰胺烟酸也叫做“维生素B3”，化学式为：C6H5NO2，它具有较高的耐热性，可升华，在常温下呈白色粉末状，它的熔点在230至240摄氏度的范围之内，能够溶于水以及其它有机溶剂，带有一定的毒性。
而烟酰胺，也叫做“尼克酰胺”，它的化学式为C6H6N2O，在常温下，通常以白色粉末状的形式存在，它的熔点在129至132摄氏度的范围之内，在水以及乙醇中易溶，可在甘油中溶解，但却不溶于乙醚，它带有一定的苦味，且其还具有比较低的毒性。
从生物以及医学角度上来看，烟酸与烟酰胺同属于维生素一族，它们普遍存在于动物的内脏、花生、乳汁、各种果类以及蛋黄中。
2 试析乳饮料中烟酸和烟酰胺的液相色谱检测法之前，由于我国社会经济条件比较落后，所以我们采用的都是较为普遍的乳粉检测法，来对乳饮料中的烟酸与烟酰胺进行检测。
但是，近年来，随着我国各个行业的发展，我国有关部门也在传统乳粉检测法的基础之上，研制出了液相色谱检测法，该检测法较传统的乳粉检测法来说，其优势更加的突出，比如：更易于操作、具有更高的灵活性、检测结果更加准确等。
另外，该检测法的出现，也对我国食品检测行业的发展提供了有利条件。
3 探究液相色谱检测法3.1 检测所需试剂及材料（1）本次检测中需要使用到的试剂，主要有：乙腈、甲醇、去离子水、异丙醇、分析纯、烟酸与烟酰胺以及庚烷磺酸钠等；（2）本次检测选取的样品为：从广西省某一乳制品生产厂中随机抽取的一袋乳饮料；（3）本次检测应用到的设备，包括：检验天平，其精确度可达到小数点后四位、滤膜，厚度为0.3微米、超高压液相色谱以及紫外检测仪等。
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食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定1范围本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法为微生物法，适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定；第二法为高效液相色谱法，适用于含量较高或强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。
第一法微生物法2原理烟酸是植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（A TCC 8014）生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将植物乳杆菌液接种至添加试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率，根据烟酸含量与透光率的标准曲线计算出试样中烟酸的含量。
3试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
培养基可购买符合测试要求的商品化培养基。
3.1试剂3.1.1盐酸（HCl）。
3.1.2氢氧化钠（NaOH）。
3.1.3氯化钠（NaCl）。
3.1.4浓硫酸（H2SO4）。
3.1.5溴麝香草酚蓝（C27H28Br2O5S）：pH指示剂。
3.1.6乙醇（C2H5OH）。
3.2试剂配制3.2.1盐酸溶液（1 mol/L）：用量筒量取吸取83 mL盐酸，于1000 mL烧杯中，加917mL 水，混匀。
3.2.2盐酸溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.1盐酸溶液10mL，加水溶解至100mL。
3.2.3氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠于1000 mL烧杯中，加水溶解并稀释至1000 mL，混匀。
3.2.4氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.3氢氧化钠溶液10mL，加水溶解至100mL。
3.2.5生理盐水（0.9%）：称取9g氯化钠（NaCl），溶解于1000ml水中，分装10mL于试管中，121℃灭菌15min，备用。
3.2.6乙醇溶液（25%）：量取200 mL无水乙醇与800 mL水混匀。
3.2.7硫酸溶液（1 mol/L）：于2000mL烧杯中先注入700mL水，用量筒量取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒入水中，用水稀释到1000mL。
3.3培养基3.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。
3.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。
3.3.3烟酸测定用培养基：维生素测定用酪蛋白氨基酸12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，p-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。
加蒸馏水至1000mL，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.7±0.2（20℃~25℃）。
注：自行配制烟酸测定培养基时，所有试剂不得含有烟酸。
3.4标准品3.4.1（C19H19N7O6）：纯度≥99 .5%。
3.5标准溶液的配制3.5.1烟酸标准储备液（0.1mg/mL）：精确称取50.0 mg烟酸标准品，用乙醇溶液（3.2.5）溶解并移至500 mL容量瓶中，定容，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于100μg烟酸。
3.5.2烟酸标准中间液（10μg/mL）：准确吸取10.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于10μg烟酸。
3.5.3烟酸标准中间液（1μg/mL）：准确吸取1.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于1μg烟酸。
3.5.4烟酸标准工作液（100ng/mL）：准确吸取5.00 mL烟酸标准中间液（3.2.2）置于50 mL 容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于100ng烟酸。
3.5.5烟酸标准工作液（40ng/mL）：准确吸取0.4mL 烟酸标准中间液（3.5.2）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于40ng烟酸。
4仪器和设备4.1天平：感量分别为0.1g和0.1 mg。
4.2均质设备：用于试样的均质化。
4.3恒温培养箱：36℃±1℃。
4.4漩涡振荡器。
4.5压力蒸汽消毒器：121℃(0.10 mPa～0.12 mPa)。
4.6离心机：转速≥2000 rpm。
4.7pH计：精度±0.01。
4.8分光光度计。
4.9超净工作台。
4.10超声波振荡器。
4.11微孔板酶标仪5菌种的制备与保存5.1菌种：植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）。
5.2储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存。
每月至少传种一次，作为储备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h以活化菌株，用于接种液的制备。
保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2~3 代以保证菌株活力。
5.3接种液的制备试验前一天，从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基（3.3.2）中，于36℃±1℃恒温培养箱中培养6 ~18h。
在无菌条件下离心该培养液15min，倾去上清液。
加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3）重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀，离心15min，倾去上清液。
重复离心和清洗步骤三次。
以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3），使其充分混合均匀制成混悬液，备用。
用721分光光度计，在550nm波长下，以0.9％生理盐水为参比，读取该菌悬液的浊度值透光值（％T），用0.9％生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在60~80％之间。
立即使用。
6试管法所有操作均需避光进行。
6.1试样制备谷薯类、豆类、坚果（去壳）等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3 mm～0.5 mm)；乳粉、米粉等试样混均；肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。
4℃冰箱保存，1周内测定。
6.2试样提取准确称取约含烟酸0.1mg的试样，一般乳类、新鲜果蔬试样2 g～5 g（精确至0.0001g）；谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2 g～1 g（精确至0.0001g），液态试样5g；乳粉、米粉等准确称取适量试样2 g（精确至0.0001g）；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1 g~0.5 g；食品0.2 g~1 g；液体饮料或流质、半流质试样5 g~10 g于100 mL锥形瓶中，加入硫酸溶液（3.2.6），加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液（3.2.6）。
在121℃下，水解30min后冷却至室温。
用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.0~6.5，再用0.1 mol/L 盐酸调pH至4.5±0.1(3.2.2)，用水定容至100mL，用无灰滤纸过滤，滤液备用。
6.3稀释根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(f)，使稀释后试样提取液中烟酸含量在50.0 ng ~500.0 ng 范围内。
6.4测定系列管制备6.4.1标准系列管取试管分别加入烟酸标准工作液0.00 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.00mL，补水至5.0 mL，相当于标准系列管中烟酸含量为0. 0 ng、50 ng、100 ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400 ng、500 ng。
加5.0 mL烟酸测定用培养基，见表1。
混匀。
每个标准点应制备3管。
表1标准曲线管的制作*试管No.1－2中不添加标准溶液；2中滴加菌液；No.3－10中添加标准品溶液的浓度依次增高。
3个重复。
6.4.2试样系列管取4支试管，分别加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL试样提取液，补水至5.0 mL，加入5.0 mL 烟酸测定用培养液，见表2。
混匀，每个浓度做3个重复。
表2试样管的制作6.4.3 灭菌：将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞，于121℃(0.10～0.12 mPa)高压灭菌5 min 。
灭菌完成后，迅速冷却，备用。
6.5 培养6.5.1 接种：在无菌操作条件下，将接种液转入无菌针管，向每支测定管接种一滴。
6.5.2 培养：将加完菌液的试管置于36℃±1℃恒温培养箱中培养16h ～24h ，直至获得最大混浊度，即再培养2 h 透光率无明显变化。
另准备一支标准0管（含0.0 ng 烟酸）不接种作为0对照管。
6.6 透光率的测定用厚度为1 cm 比色杯，在波长550 nm 条件下读取透光值，将培养好的测定管用漩涡混匀器混匀。
以未接种0对照管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。
如果0对照管有明显的细菌增长；或与0对照管相比，标准管透光率在90%以下，、说明可能有杂菌或不明来源烟酸混入，需重做实验。
取出最高浓度标准曲线管振荡5s ，测定透光值，放回重新培养。
2h 后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。
6.7 标准曲线的绘制以标准系列管烟酸含量为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线，也可对各个标准点做拟合曲线。
各个标准点3管之间的透光率的相对标准偏差应小于10%，如果某一标准点3支试样管中有2支烟酸含量落在50 ng ～500 ng 范围内，且该两管之间折合为每mL 试样提取液中烟酸含量的偏差小于10%，则该结果可用，如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%，则该点舍去，不参与标准曲线的绘制。