生物分子类实验室常用实验技术原理汇总
项目一(五)：常用生物化学实验技术及原理
2、特点
吸光光度法同滴定分析法、重量分析法相比，有以下一些特点：
(1)灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达1-10-3%的微量
组分。对固体试样一般可测到10-4%。如果对被测组分事先加以富集，灵 敏度还可以提高1-2个数量级。 (2)准确度较高
一般吸光光度法的相对误差为2-5%，其准确度虽不如滴定分析法及 重量法，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴 定分析法和重量法也不够准确了，甚至无法进行测定。 (3)操作简便，测定速度快 (4)应用广泛
层色谱和纸色谱。
（4）按照展开程序分类
按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。 ▪ 洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸
附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在 固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从 而使组分彼此分离。流出曲线下图
（2）光的吸收定律：朗伯－比尔定律
当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在 单色光强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液吸光 度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。 A＝KcL 朗伯－比尔定律不仅适用于有色溶液，也适用于无色溶液 及气体和固体的非散射均匀体系；不仅适用于可见光区的 单色光，也适用于紫外和红外光区的单色光。
而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物 大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作 用而导致所提物质生物活性的丧失。 生物大分子的制备一般分为以下四个阶段：
①选择材料和预处理； ②细胞的破碎及细胞器的分离； ③提取和纯化； ④浓缩干燥和保存(冷冻干燥)。
（二）色谱分离技术
色谱分离技术，又称层析分离技术或色层分离技术，
史上最全的30个生物实验技术及原理!(一)2024
史上最全的30个生物实验技术及原理!（一）引言概述：生物实验技术的快速发展在许多领域中发挥着重要作用。
本文将介绍史上最全的30个生物实验技术及其原理，希望能够为读者提供一些有关生物实验的有用信息和启发。
本篇文档将详细阐述其中的五个大点，并在文末进行总结。
正文：1. PCR技术（聚合酶链式反应）及其原理a. 反应原理：DNA的扩增b. 所需材料和试剂c. 反应步骤d. PCR在基因检测和疾病诊断中的应用e. PCR扩增的局限性和优化方法2. Western Blot技术及其原理a. 反应原理：蛋白质的检测和定量b. 所需材料和试剂c. 实验步骤d. Western Blot在蛋白质研究中的应用e. Western Blot的优缺点及其改进方法3. 细胞培养技术及其原理a. 细胞培养的目的和意义b. 常用的细胞培养基和培养环境要求c. 细胞培养的方法和步骤d. 细胞培养在药物筛选和细胞研究中的应用e. 细胞培养的注意事项和常见问题解决方法4. ELISA技术（酶联免疫吸附测定法）及其原理a. 反应原理：特定抗原或抗体的检测b. 所需材料和试剂c. 实验步骤d. ELISA在免疫学和生物医学研究中的应用e. ELISA的优点和缺点，以及改进方法5. 荧光显微镜技术及其原理a. 反应原理：荧光信号的检测和成像b. 所需设备和试剂c. 实验步骤d. 荧光显微镜在细胞和组织成像中的应用e. 荧光显微镜的局限性和技术进展总结：本文介绍了史上最全的30个生物实验技术及其原理。
从PCR 技术、Western Blot技术、细胞培养技术、ELISA技术到荧光显微镜技术，每个大点均分别阐述了技术的原理、所需材料和试剂、实验步骤、应用领域以及优缺点。
这些实验技术在生物医学研究、药物开发和生物工程等领域中起着重要作用。
读者可以根据自己的研究需求和兴趣，选择适合自己的技术进行实验和研究。
在使用这些技术时，应注意实验操作的细节和安全性，以提高实验的准确性和可靠性。
分子生物学实验讲义
实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
第20章常用分子生物学技术的原理及其应用
第20章常用分子生物学技术的原理及其应用分子生物学技术是研究生物分子结构、功能、调控及其相互关系的重要手段，具有识别、分离、纯化、检测和重组生物分子的功能。
在生命科学研究和生物技术应用中，常用的分子生物学技术主要包括核酸提取、聚合酶链式反应（PCR）、限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）、DNA测序、原位杂交、Northern和Southern blot杂交等。
下面将介绍这些常用分子生物学技术的原理及其应用。
1.核酸提取：核酸提取是从细胞或组织中获得目的核酸的方法。
其原理是通过细胞破碎及蛋白酶消化等步骤，将细胞内的核酸释放出来，并进行纯化。
核酸提取技术广泛应用于基因克隆、基因组学研究、医学诊断以及法医学中的DNA分析等领域。
2.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种体外合成DNA的技术，通过多轮的循环温度反应，可以快速扩增一段特定的DNA序列。
其原理是利用DNA聚合酶酶活与特定引物的作用，在一系列温度循环中，使DNA序列通过链分离、引物结合、DNA合成循环进行扩增。
PCR技术被广泛应用于基因分型、基因克隆、突变检测、DNA测序等领域。
3.限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）：RFLP是一种检测DNA序列多态性的方法，通过限制酶切割目的DNA，在凝胶电泳中观察DNA片段的长度差异。
其原理是利用限制酶对特定序列的识别和切割，形成不同长度的DNA片段，经凝胶电泳分离，通过核酸探针杂交或染料染色等方法来观察差异。
RFLP技术广泛应用于基因分型、基因组学研究、变异检测等领域。
4. DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的方法，通过测定DNA的碱基顺序，揭示基因组结构和功能。
常用的DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序。
Sanger测序原理是利用DNA聚合酶、引物和一种特殊的停止链终止剂，在DNA合成过程中随机终止，形成不同长度的DNA片段，通过电泳分离后，通过染料或探针检测碱基顺序。
高通量测序技术基于快速测序平台和大规模并行测序，提高了测序效率和准确性，广泛应用于基因组学、转录组学等领域。
生物的分子生物学实验与技术
生物的分子生物学实验与技术生物的分子生物学实验与技术在当代生命科学研究中扮演着重要的角色。
通过这些实验与技术，科学家们能够深入了解生物体内的分子机制以及其与生命活动之间的关系。
本文将介绍一些常用的分子生物学实验与技术，并展示它们在不同研究领域中的应用。
一、DNA提取与纯化技术DNA提取是分子生物学实验的基础步骤之一，它能够从生物样本中扩增和分析DNA。
目前，常见的DNA提取方法包括酚-氯仿法、离心法和商用DNA提取试剂盒。
这些方法能够高效地提取DNA，并保持其完整性和纯度，为后续的实验提供可靠的基础。
二、聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应是分子生物学研究的重要手段之一。
它通过反复扩增特定DNA片段，从而获得大量的DNA复制物。
PCR技术广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域。
近年来，随着PCR技术的不断发展，新型的PCR方法如荧光定量PCR和数字PCR 等也逐渐应用于实验室研究。
三、基因测序技术基因测序技术是了解生物体内基因组组成和基因功能的重要途径。
随着二代测序技术的出现，如Sanger测序、Illumina测序和OXFORD NANOPORE等，大规模、高通量的基因测序已成为可能。
基因测序技术为研究者提供了全面了解生物基因组的机会，并对遗传疾病的诊断和治疗提供了重要依据。
四、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
目前，常见的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析和透析等。
这些技术能够分离蛋白质并去除与之相伴的其他污染物，从而获得高纯度的蛋白质样品。
蛋白质纯化技术在蛋白质研究、药物开发和生物工程等领域具有广泛的应用价值。
五、蛋白质组学技术蛋白质组学技术是研究生物体内蛋白质组成和功能的重要手段。
质谱分析和二维凝胶电泳是常用的蛋白质组学技术。
质谱分析能够高效地鉴定蛋白质样品中的蛋白质，并测定其分子量和氨基酸序列。
二维凝胶电泳则能够将蛋白质在物理性质和化学性质两个维度上进行分离，从而得到蛋白质在空间位置和表达水平上的信息。
现代分子生物学实验原理与技术
2.实验方案 1 基因操作实验的主要目的有三个：
①分离目的基因,获取DNA信息； ②分析基因结构； ③分析基因功能,
2 试验流程设计 首先,应确定使用怎样的研究方案； 其次,根据试验规模和研究室情况； 最后,根据研究人员生活规律确定试验时间,
3.实验方法 在设计实验方法时应考虑 ①能否达到实验目的； ②是否符合实验室现状； ③是否符合自己的喜好,
步骤：①胰蛋白酶8g
酵母提取物4g
三角瓶
NaCl 8g
②加双蒸水至800ml,混合均匀,
③高温高压灭菌,室温保存,
2 制作平板
材料：煤气灯或酒精灯
水平台面
1L三角瓶
铝箔纸
直径9cm的培养基
药匙
试剂
琼脂粉
步骤：①胰蛋白酶8g
酵母提取物4g
三角瓶
NaCl 8g
琼脂粉
②铝箔纸封口,混匀,灭菌, ③待冷却至60℃左右,分装至培养皿, ④水平台上凝固, ⑤倒置塑料袋中4℃保存,
烧,将初始培养菌转入大量培养基中,盖上 盖子,再灼烧瓶口,
④37℃震荡过夜, 3 菌落测定
平台期
对数生长期
诱0时
为指数生长期,A 6＞00 1.0 为平台期,A =1.6000为10 个/ml8,
①在煤气灯旁用微量移液器吸 培养液,转至Eppendrof管, ②打开分光光度计,调整波长 至600nm,
注意： 1、若需要加入抗生素,待冷却至60℃ ,分装前加 入, 2、直径9cm的平皿,每皿25ml为宜, 3、尽量缩短平皿开盖时间,分装的培养基很快凝 固,因此操作要快, 4、凝结在盖上的水珠可能至污染,故倒转存放, 5、氨苄青霉素易失活,添加后的平皿应在数 （ZHOU）内使用,
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍分子生物学是研究生物分子的结构、功能和相互作用的一门科学。
为了研究分子生物学，科学家们开发了一系列实验方法来解析生物分子的结构和功能，从而揭示生物学的奥秘。
以下是一些常用的分子生物学实验方法的原理介绍。
1.DNA分离与纯化实验方法DNA是分子生物学研究的重要对象之一、DNA分离与纯化是获取纯净DNA样品的最基本步骤。
DNA可以通过细胞裂解、蛋白酶处理和有机溶剂萃取等方法从生物样品中分离出来。
DNA纯化则通过离心、凝胶电泳、柱层析等手段去除杂质，得到高纯度的DNA。
2.RNA提取与纯化实验方法RNA是转录过程中产生的核酸分子，具有调控基因表达的功能。
RNA提取与纯化是研究RNA的第一步。
常用的方法包括酚/氯仿法、硅胶柱层析法和磁珠法等。
通过这些方法，可以从生物样品中纯化出RNA，并通过凝胶电泳或分光光度计等手段评估纯化效果。
3.蛋白质提取与纯化实验方法蛋白质是生物体内重要的功能分子，它们参与几乎所有的生物过程。
研究蛋白质功能的首要步骤就是提取和纯化蛋白质。
蛋白质提取方法包括细胞裂解、超声波处理和离心等。
蛋白质的纯化则通过不同的方法，如离心沉淀、柱层析、电泳和亲和层析等手段，从混合物中分离出目标蛋白质。
4.凝胶电泳实验方法凝胶电泳是一种分离和分析生物分子的常用方法。
凝胶电泳可以通过差异的电荷、大小和形状来分离DNA、RNA和蛋白质等分子。
常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
通过凝胶电泳，我们可以分析DNA片段的大小、RNA的表达水平以及蛋白质的组成和纯度。
5.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种通过体外扩增DNA序列的技术。
PCR的核心是DNA的反向转录和DNA序列的扩增。
PCR反应体系主要由DNA模板、引物、dNTP、聚合酶和缓冲液组成。
反应通过循环加热和降温来实现，每个循环包括DNA的变性、引物的结合和DNA的延伸。
PCR技术可以扩增DNA片段，从而用于DNA测序、基因克隆、基因突变分析等研究。
分子生物学常用实验技术概述
分子生物学常用实验技术概述分子生物学是研究生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质等）组成、结构和功能的科学领域。
在分子生物学的研究中，常用各种实验技术来解析生物大分子的结构和功能，为科学研究和应用提供依据。
下面将概述一些常用的分子生物学实验技术。
1.PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种能在体外快速扩增DNA序列的技术，可以从一个DNA模板扩增出百万倍的DNA片段。
PCR包括三个步骤：变性、退火和延伸。
通过PCR，可以在短时间内扩增大量特定的DNA 片段，并常应用于基因分析、疾病诊断以及基因工程等领域。
2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体细胞中，使其表达外源蛋白或产生新的表型。
转基因技术通常包括四个步骤：基因分离、基因克隆、基因传递和基因表达。
转基因技术在农业、医学和生物科学研究中具有广泛的应用。
3.蛋白质电泳：蛋白质电泳是根据蛋白质的电荷和大小差异将其分离的一种方法。
常用的蛋白质电泳方法包括SDS-和二维电泳。
蛋白质电泳可用于纯化蛋白质、分析蛋白质组成以及检测蛋白质的修饰。
4.蛋白质质谱：蛋白质质谱是一种分析蛋白质的结构和功能的方法。
常用的蛋白质质谱技术包括MALDI-TOF质谱和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。
蛋白质质谱可用于鉴定未知蛋白质、确定蛋白质的氨基酸序列以及检测蛋白质的修饰等。
5.分子克隆：分子克隆是将外源DNA或RNA序列插入到载体DNA中，并通过细胞转染等方法将其导入到目标细胞中进行表达的过程。
分子克隆常用的方法包括限制性内切酶切割、连接反应、质粒构建和转染等步骤。
分子克隆技术可用于分析、表达和研究目标基因。
6. Northern blotting：Northern blotting是一种检测RNA的方法，常用于检测特定的mRNA分子。
在Northern blotting中，通过RNA的电泳分离、转移、固定以及杂交等步骤，可以检测目标RNA的存在和表达水平。
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一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA 序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA 和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。
基因芯片主要用于基因检测工作。
基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。
当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
据此可重组出靶核酸的序列。
五、高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。
当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。
六、酵母双杂交（Y2H）七、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。
所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
八、RNA提取（Trizol法）Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA 和蛋白质。
九、RT-PCR2、反转录合成cDNA；3、PCR扩增；4、产物的电泳和结果的测定。
十、实时荧光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR ）利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期。
C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数。
十一、BCA法测蛋白质浓度十二、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）制备1、前夜接种受体菌（DH5DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2、取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3、将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5、4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 、4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8 、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 、细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
十三、碱变性提取质粒DNA碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc 高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选（1）总过程：分---PCR分离目的基因切---限制性内切酶切割接---目的基因与载体相连转---转入宿主细胞筛---筛选阳性重组体（2）分---PCR分离目的基因：PCR克隆、同源克隆、文库筛选（3）切---限制性内切酶切割：粘性末端、平末端（4）接---目的基因与载体相连原理：利用DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性和利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接。
（5）转---转入宿主细胞感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
（6）筛---筛选阳性重组体十五、RNA干扰（RNAi）一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。
十六、cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
十七、基因文库和cDNA文库的构建（看课本上的）十八、mRNA差异显示技术（DD-PCR）mRNA差异显示技术是将mRN A逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。
每一种细胞（包括同一组织细胞经过不同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱（有差异基因表达），即特异的RNA指纹图谱。
差异基因表达是细胞分化的基础，正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和凋亡等。
mRNA DDR T－PCR 技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。
其基本原理是从基因背景相同的2个或几个被比较的细胞系或组织中提取总RNA，逆转录成cDNA ，用不同引物对，进行PCR 扩增，扩增时加入同位素标记的核苷酸。
利用测序胶电泳技术分离PCR 产物，经放射自显影即可找到差异表达的基因。
十九、抑制差减杂交抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差减杂交方法相结合的方法。
其依据的主要技术有两点:(1)消减杂交;(2)抑制PCR。
经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。
抽提两种不同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。
第一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的testercDNA双链;c是tester和driver 的异源双链;d是drivercDNA。
根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。