现代分子生物学实验原理与技术
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
分子生物学——原理与技术
分子生物学——原理与技术分子生物学是现代生物学中的一门重要科学，研究生物体的分子结构、功能和相互作用。
它是以DNA、RNA、蛋白质等重要分子为研究对象，探究它们的生物学意义，是基因工程和生物技术的理论基础，也是解决很多现代生物医学问题的关键。
一、 DNA、RNA和蛋白质分子生物学的研究对象包括DNA、RNA和蛋白质三种重要分子，这三种分子在细胞中各自发挥着至关重要的作用。
1. DNADNA（Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸），是构成基因的物质，是决定遗传信息及其表达的物质基础。
它由四种不同的碱基组成，分别是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（C）和胞嘧啶（G）。
DNA的结构像一条双链，两条链通过碱基互补配对而保持高度的稳定性和准确性，即A氢键与T 碱基配对，C氢键与G碱基配对。
2. RNARNA（Ribonucleic acid，核糖核酸），具有多种功能，如携带遗传信息、参与蛋白质合成、调节基因表达等等。
RNA的组成与DNA相似，同样由四种碱基组成，区别在于RNA中的胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）替代，且RNA是单链分子，而不是DNA的双链。
3. 蛋白质蛋白质是生物体内最重要的有机分子之一，也是分子生物学研究的重点之一。
蛋白质通过氨基酸的序列组成，不同的氨基酸序列决定了不同的功能和空间结构。
蛋白质在细胞中扮演着重要的角色，如酶催化反应、维持细胞结构、参与信号传导等等。
二、分子生物学基础技术分子生物学的研究方法主要包括分离、纯化、检测和克隆等技术手段。
下面就一些典型的实验方法进行说明：1. DNA分离与纯化方法（1）酚-氯仿：利用酚（Phenol）和氯仿（Chloroform）进行分离。
由于DNA对极性较弱，所以可以在酚-水界面处沉淀下来，然后利用氯仿分层，最后从水层中分离DNA。
（2）膜过滤：膜过滤法是利用孔径不同的膜进行分离纯化DNA。
一般使用微孔聚丙烯膜，按孔径大小可分为A、B、C三种不同的型号。
分子生物学实验3篇
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容RT-PCR（一）总 RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。
8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- FreeWater）将RNA 溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
二）反转录实验安排：每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样μl4 5× Bufferμl6dNTPsμl1RNA 酶抑制剂μl1Oligo （dT）μ随机引μ反转录AMV1μ提取RNA6总体μ201h42反应条件：℃注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
现代分子生物学实验原理与技术
现代分子生物学实验原理与技术现代分子生物学实验原理与技术是生物学领域中重要的研究方法，旨在帮助研究者们更好地分析、解释和理解生物体的结构和功能。
它可以帮助我们更深入地了解生物体如何运作以及我们如何影响它们的结构和功能。
现代分子生物学实验原理与技术包括：质粒克隆、聚合酶链式反应（PCR）、DNA测序、定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附分析（ELISA）、RNA干扰等。
质粒克隆是一种技术，它可以复制指定的DNA片段，并将其结合到另一个DNA分子中，使之变得稳定。
它可以用来构建合成的基因，制造复合基因组，分析基因表达，研究遗传病理学，以及研究各种现代生物学问题。
聚合酶链反应（PCR）是一种快速、简便的技术，它可以使目标基因的副本数增加几十万倍以上，扩增出精确的片段。
它可以用来识别DNA样本来源，测定DNA的结构变异，以及研究基因的表达。
DNA测序是一种技术，它可以识别和排序DNA或RNA片段中的碱基对顺序。
它可以用来确定基因、基因组和DNA突变，诊断多种疾病，以及研究基因组结构和功能。
定量PCR（qPCR）是一种技术，它可以快速、准确地测定DNA或RNA含量，用于研究基因表达和调节。
它可以被用来定量分析细胞周期的变化、同工酶的表达水平，以及研究某些基因突变和表达时机的变化。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种可以测定抗体或抗原浓度的技术。
它可以用于诊断传染性疾病、研究免疫学问题，以及检测和评估抗体，以及检测毒素和药物的有效性。
RNA干扰技术可以抑制特定基因的表达，这种技术可以用来研究基因的功能，以及抑制病原体的繁殖和感染。
此外，RNA干扰还可以用来开发抗病毒疫苗，用来治疗疾病。
综上所述，现代分子生物学实验原理与技术包括质粒克隆、聚合酶链式反应、DNA测序、定量PCR、酶联免疫吸附试验和RNA干扰等，它们是分子生物学研究不可或缺的重要工具，可以帮助研究者们更深入地理解生物体的结构和功能。
分子生物学的原理和实验技术
分子生物学自20世纪50年代以来经历 了飞速的发展，包括DNA双螺旋结构 的发现、基因工程的诞生、人类基因 组计划的完成等重大里程碑事件。
研究对象与内容
研究对象
分子生物学主要研究生物体内的 核酸（DNA和RNA）和蛋白质等 大分子物质。
研究内容
包括基因的结构与功能、基因表 达的调控、DNA复制与修复、 RNA的转录后加工与调控、蛋白 质的合成与功能等。
蛋白质定量与检测
利用BCA法、Bradford法等方法对蛋白质进行定量，并通过 Western blot等技术检测特定蛋白质的表达。
蛋白质相互作用研究
利用免疫共沉淀（Co-IP）、酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的 相互作用。
细胞培养与转染技术
细胞培养
在人工环境下培养细胞，提供适 宜的营养物质和生长条件，维持
随着大数据时代的到来，生物信息学分析方法在分子生物学研究中的地位愈发重要。未 来需要发展更加高效、准确的算法和工具，以应对不断增长的数据分析需求。
THANKS
感谢观看
细胞的生长和增殖。
细胞转染
将外源DNA或RNA导入真核细 胞中，实现基因的表达或调控。 常用的转染方法包括脂质体转染
、电穿孔转染等。
细胞筛选与鉴定
利用选择性培养基、抗体筛选等 方法对转染后的细胞进行筛选和 鉴定，获得具有特定表型的细胞
株。
04
分子生物学在医学领域应用
基因诊断原理与方法
基因诊断原理
蛋白质合成与功能
转录与翻译
01
DNA中的遗传信息通过转录生成RNA，再经过翻译合成蛋白质
。
蛋白质的结构与功能
02
蛋白质的结构决定其功能，包括催化、运输、免疫等。
现代分子生物学技术及实验技巧
现代分子生物学技术及实验技巧1 自由基技术自由基技术是分子生物学中的一种技术，它能够探测分子物质中的自由基浓度以及自由基的反应，从而深入研究分子物质的性质。
自由基技术采用的是自由基信号分子，通过对其进行观察或者对其进行探测和量化，可以了解分子物质的反应过程和分子物质中自由基的浓度。
2 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术是一种分子生物学技术，是一种能够进行DNA 复制的技术。
聚合酶链式反应技术可以迅速扩增DNA片段，因此被广泛应用于DNA检验、生物工程、基因工程等领域。
聚合酶链式反应技术的原理是，在适当的酶和DNA单链片段存在的条件下，通过反复进行变性、退火和扩增等步骤，将DNA片段快速扩增至数量足够进行检验。
3 基因编辑技术基因编辑技术是一种通过人工干预改变生物个体基因组序列的技术。
基因编辑技术主要应用于基因治疗、育种、制药等领域，能够快速地对基因组进行编辑，从而改变生物的基因表达及特性。
现如今，基因编辑已经成为研究生命科学、探求生命本质的一项重要技术手段。
4 蛋白结晶技术蛋白结晶技术是一项关键提取遗传工程、药物研发和生物晶体学所需的蛋白质结晶技术，是在分子生物学中应用广泛的一种实验技术。
它可用于发现新药物、解决蛋白质功能、交互和酶学机制等多方面的问题，从而促进分子生物学、药学、生物技术、医药化学等领域的发展。
蛋白结晶技术的发展，对于建立高清晰度的蛋白质立体结构图库至关重要，对于发现生命科学的秘密有重要的作用。
5 特异性溶解曲线PCR技术特异性溶解曲线PCR技术是一种在PCR扩增反应中，通过检测DNA 的特征溶解温度来区分目标DNA和异质DNA的技术。
该技术结合了不需要胶回的扩增、高诊断准确性和高速度等优点，极大地提高了实验效率。
特异性溶解曲线PCR技术的应用使DNA的扩增和监测更加精确、简单和操作高效，可以广泛地应用于生命科学研究、临床试验等领域。
现代分子生物学实验原理与技术2
2、溴化乙锭（EB）
结合于双链DNA的EB被紫外线照射时可产生 橙色荧光，因此可用于DNA的检测。
第三节 DNA浓缩
1、乙醇沉淀
盐能中和核酸上的电 荷，因此易使DNA DNA不溶于乙醇，因此可用乙醇来沉淀DNA以达到 沉淀，但加入过多易 产生盐析。 纯化DNA的目的。乙醇沉淀是浓缩DNA的常用方法。
有三种缓冲液可用于溶解或保存DNA:
•TE [10mmol/L Tris.HCl,1mmol/LEDTA] •0.1*TE（用于酶促反应） •T E [50mmol/L Tris.HCl,1mmol/LEDTA],用于溶解pH不稳定的 DNA。
2、如何处理溴化乙锭污染物才不致污染环境？ •大于0.5mg/mL浓度的EB溶液处理：a用水稀释 至浓度小于0.5mg/mL；b加等体积0.5mg/mL KMnO4，混匀，室温放置数小时；c再加入等体 积1.5mol/L HCl，混匀，室温放置数小时；d再 加入等体积1.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 •小于0.5mg/mL浓度的EB溶液处理：a按1mg/mL 量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1h；b 用滤纸过滤并将活性炭与滤纸密封后丢弃。 •固体EB废弃物可用高温消毒方法处理。
1、从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落， 1ml新鲜的16~20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB 培养基的1L或500ml烧瓶中。于37 ℃剧烈振摇培养约 2~3小时（旋转摇床200~300r/min），每隔20~30分钟 测量OD600值≈0.4 2、在无菌条件下将细菌转移到一个用冰预冷的50ml聚 丙烯离心管中，在冰上放置10~20min。 3、于4 ℃用SorvallGS2转头（或与离心管相配的转 头），以4000r/min 离心10min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培 养液流尽。 5、以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2 重悬每份沉淀， 放置冰上20min。
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2、微量移液器（枪）
使用方法 调节时，自大到小。由小值 调到大值时，应多调1/3圈， 再反调至设定值。
现代分子生物学实验原理与技术
3、恒温水浴锅
多用于酶促反应，将Eppendrof管插入浮漂中 进行反应。
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4、小型离心机
离心甩干是指短时间（1~3s）的离心操作，目 的是使附着于管壁的液体沉入管底。
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9、紫外发光装置
防护板（贴有起保护作用的保鲜 膜型，短波光
线强，对DNA损伤大。实验室一般使用中波，使用时
应戴上防护眼镜。因灯管和过滤板有使用寿命，用完
后及时关闭。
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10、一次性手套 ①防止危险试剂沾到手上。 ②防止试剂受到污染。
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3.实验方法 在设计实验方法时应考虑 ①能否达到实验目的； ②是否符合实验室现状； ③是否符合自己的喜好。
经费预算 实验周期
实验目的
爱好
实验方法
精度
仪器性能
速度 准确性现代分子生物学实验原理与技术
因确 素定
实 验 方 法 时 应 考 虑 的
4.实验遵循的原则 ①忠于实验流程 ②关注实验要点 ③准备充足的实验材料
⒈实验室规则 ⑴保持肃静 ⑵保持整洁 ⑶严格操作 ⑷注意节约 ⑸保证安全
⒉实验室常识 ⑴使用贵重仪器如分析天平、分光光度剂、离心
机等倍加爱护，使用前熟知使用方法，使用时 严格遵守操作规程，发生故障时，立即关机。 ⑵凡挥发性、有烟雾、有毒和有气味的实验，均 应在通风柜内现进代分行子生。物学实验原理与技术
①强碱：大量清水稀释，涂5%硼酸或2%乙酸 ②强酸、溴：大量清水稀释，5%NaHCO3或5%氨水 ⑹煤气中毒 呼吸新鲜空气 现代分子生物学实验原理与技术
思考题： ⒈什么是DNA重组技术？其实验的主要目的是 什么？ 答案 ⒉试分析有些人工作很辛苦，但总得不出理想实验结
果的原因。答案 ⒊如何获得你需要的实验材料（特别是未商品化的材
料）？答案 ⒋什么是《实验室生物安全通用要求》（GB 1948
9-2004）？据此生物学实验室可分几级？答案 ⒌实验室发生火灾时该如何处理？烫伤、灼伤时该如
何处理？答案 ⒍如何处理对环境有污染的试剂？答案
现代分子生物学实验原理与技术
第二章 仪器操作与溶液配制
第一节 常用器皿与仪器
1、塑料制品 Eppendrof 管
2、储液
3、试剂称量精度 一般称量精度为3位有效数字。
4、试剂灭菌 不可高温高压灭菌的试剂有： ①遇热易分解的试剂 ②易挥发的试剂 ③有机溶剂 ④腐蚀性、刺激性强的试剂。
现代分子生物学实验原理与技术
5.实验材料的准备 •购买 •利用公共服务机构 •接受馈赠
写求助信要注意： ①你需要什么？ ②及时、真实的将相关信息告诉对方，不能隐瞒。 ③通常向论文通讯作者寻求帮助。 ④写信的稿纸是印有单位标志、名称、电话号码等 信息的公函纸。
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第二节 实验室规则与安全
⑶配制试剂时，应对试剂纯度、结构式、分子质量等 特性熟悉，做到“有的放矢”。
⑷量瓶是量器，不要用量瓶做容器。 ⑸洗净器皿应倒置架上，使其自然风干。 ⒊实验室安全 ⑴《实验室生物安全通用要求》查看 ⑵了解电闸、水阀煤气总阀门所在处，离开实验室检
查是否关好。 ⑶使用电器设备时严防触电。 ⑷使用高温高压锅灭菌时不得离人。 ⑸使用可燃物，特别是易燃物，应特别小心。 ⑹凡使用腐蚀性试剂，必须谨慎操作，防止溅出。 ⑺废液特别是强酸强碱，应稀释后倒入水池。 ⑻有毒物品应按照实验室规定办理审批手续后方可领 取，使用时严格现操代作分子，生物用学实后验原妥理与善技术处理。
“扩”是指目的DNA在宿主/载体系统 中进行扩增。
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2.实验方案 （1）基因操作实验的主要目的有三个：
①分离目的基因，获取DNA信息； ②分析基因结构； ③分析基因功能。
（2）试验流程设计 首先，应确定使用怎样的研究方案； 其次，根据试验规模和研究室情况； 最后，根据研究人员生活规律确定试验时间。
11、纸巾 吸走残余液体，一般卫生纸就可以。 擦拭实验用品（如玻璃板）时，要用专用、不 带毛屑的面巾纸。
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第二节 溶液
1、实验用水 一蒸水：多用于大肠杆菌培养基的制备、电泳 缓冲液的配制、器皿的漂洗的实验。 二蒸水：用于生物化学及组织培养实验。
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⒋实验室急救 ⑴触电
①关闭电源； ②用干木棍将导线与被害者分开； ③将被害者移至木板上，与地面分离； ④急救者必须做好触电安全措施，手脚必须绝缘。
⑵火灾 隔绝氧气 ①起火物与水相容：水、湿布、沙土、灭火器等 ②起火物与水不相容：不可用水
⑶烫伤 乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染 ⑷玻璃割伤或其他器械损伤 清理伤口，硼酸水洗净，涂碘酒，包扎 ⑸灼伤皮肤
现代分子生物学实验 原理与技术
现代分子生物学实验原理与技术
第一章 绪论
第一节 基因操作技术
1.基因操作技术
基因操作技术（重组DNA技术、基因工 程）是在DNA水平上阐明生命现象的技术， 包括DNA的“切”、“连”、“扩”等。
“切”指限制性内切核酸酶切割DNA。 “连”指用DNA连接酶连接两个DNA 片段。
④设平行对照实验 ⑤准确的试剂用量 ⑥数据整理
注意： ⑴第一次实验成功，第二次实验马虎。 ⑵实验精度：①必须严格按照实验流程进行的操作；
②较严格的实验操作，允许5%的变动； ③允许20%变动的实验操作； ④不需要特别注意的实验操作。
⑶酶促反应不顺利时，若加入更多的酶或DNA，结果会 越来越糟。
⑷不设平行对照实验往往是实验失败的原因。 ⑸样本标记的零乱也往往是实验失败的重要原因。
现代分子生物学实验原理与技术
5、离心干燥机
目的是使DNA样品快速干燥。
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6、旋涡混合器
利用不对称的旋转将管内液体混匀。
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7、振荡器
搅拌离心管内液体，加速难容物溶解，清洗浸泡于 溶液中的不洁器皿。
现代分子生物学实验原理与技术
8、真空泵
利用真空吸走液体，作用与离心干燥机或凝胶干 燥机类似。