乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化工艺研究

乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化工艺研究陶静*，凌飞跃，张博，宋佳静，周安琪，纵伟（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450002）摘要：乳酸菌胞外多糖分离纯化的步骤一般可由蛋白质的分离、多糖的提取纯化和粗多糖的纯度鉴定三个部分组成。

本文对分离蛋白以及乙醇沉淀多糖阶段中各个条件分别进行单因素优化实验，正交试验得到乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化的最佳工艺条件为60%三氯乙酸处理后14000×g离心40 min可有效除去发酵液中多数蛋白质，用3倍体积100%乙醇处理12 h可有效沉淀多糖。

得到纯度高、含杂量低粗多糖，有利于进行进一步结构鉴定和分析，为乳酸乳球菌胞外多糖的进一步研究和应用提供了理论依据。

关键词：乳酸菌；胞外多糖；多糖提取；工艺优化中图分类号：TS202.1/Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）10-0100-05doi：10.19804/j.issn1006-2513.2019.10.010Study on extraction and purification technology of Lactococcus lactisexopolysaccharideTAO Jing*，LING Fei-yue，ZHANG Bo，SONG Jia-jing，ZHOU An-qi，ZONG Wei （School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry 450002）Abstract： The isolation and purification of EPS LAB include three stages： protein isolation， purification and identification of polysaccharides. In this paper， a single factor optimization experiment was carried out on various conditions， which involved in separation of proteins and the ethanol precipitation， finally， the orthogonal experimentis designed to prove the results， to find the best conditions for the extraction of Lactococcus lactis LAB. Results showed that after the treatment with 60% TCA， under the centrifugal force of 14000×g and last 40min， the vast majority of proteins in the fermentation broth can be removed efficiently； the optimum process for the precipitation of polysaccharides was 3 times the volume of 100% ethanol for the treatment of 12h. The purpose of this study is to obtaina high purity polysaccharide products， which is conducive to the further structural identification and analysis， provides theoretical basis for further research and application of Lactococcus lactis LAB.Key words： Lactic acid bacteria（LAB）；exopolysaccharide （EPS）；extracellular polysaccharide；process optimization乳酸乳球菌胞外多糖（EPS）为乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类多糖类化合物［1］。

由于乳酸菌相比其他工业用菌安全性高，故近年来对乳酸菌胞外多糖的研究也逐渐增多。

从已有的研究结果来看，合成EPS的乳酸菌中乳酸乳球菌合成能力较强［2］，为80～600mg/L［3-4］。

胞外多糖作为食品添加剂［5］，可用作多种食品的增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂［6］；具有生物收稿日期：2019-06-21 *通讯作者作者简介：陶静（1979-），女，副教授，硕士，研究方向：微生物发酵与保健品研发。

taojing@。

100活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域［3］，分子量大约为4.0×104～6.0×106之间［7］。

尽管长期以来研究者们对乳酸菌产EPS的化学组成存在着分歧，但是较一致认为：从乳酸菌中分离得到的胞外聚合物是由α-和β-连接糖重复单元所组成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS类型不同［8］。

虽然单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同［1］。

由于发酵液中EPS的产量较低、蛋白质含量较高，给EPS的提取带来较大困难［9］。

因此，发酵液中提取EPS工艺关键即是蛋白质的除去与EPS的沉淀，可得到稳定、易使用、杂质少的多糖产品。

本实验对乳酸乳球菌发酵液通过不同的条件进行提取纯化EPS，验证最佳除蛋白条件和多糖沉淀条件，为工业化生产乳酸菌胞外多糖奠定理论基础。

1 材料与方法1.1 材料与试剂乳酸乳球菌乳亚种LL9（Lactococcus lactis ctis LL9）（以下简称乳球菌LL9）：郑州轻工业学院实验室提供，由乳酸乳球菌乳亚种6242（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC））紫外诱变，经葡萄糖耐受及乳链菌肽耐受水平筛选挑出，比较生物活性最终筛出活性高、乳链菌肽产量高的最优化菌株。

分离纯化条件为：发酵液→添加三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min搅拌5min→4℃沉淀除蛋白20min→10000r/s离心20min除菌体→上清液透析12h→苯酚硫酸法测定EPS。

可得乳酸菌胞外多糖的产量为262.63mg/L［2］。

6%的苯酚溶液：精确称取6.0g重蒸酚晶体，用少量的蒸馏水溶解后倒入100mL的容量瓶中，定容、充分摇匀，倒入棕色试剂瓶中备用［10］。

1.2 实验方法1.2.1 菌种活化保存于甘油管中乳球菌LL9接种于MRS液体培养基内，37℃培养，传代2～3次后，染色镜检，挑选优良菌株，转接斜面培养，4℃冰箱冷藏保藏备用。

1.2.2 摇瓶发酵活化后菌液5%转入摇瓶发酵，37℃恒温150r/min震荡培养24h。

1.2.3 发酵液处理取发酵终点发酵液，10000×g下离心8min 去除菌体，取上清液备用。

1.2.4 苯酚硫酸法测定EPS该方法较适合乳酸菌EPS检测，相对误差为0.2%，具有较好的准确性［9］。

透析液经稀释取2.0mL加入1.0mL 6.0%的苯酚溶液，5.0mL 95.0%的浓硫酸，静置10min，高速振荡器上振荡摇匀，静置20min至冷却。

490nm测定OD 值。

标准曲线上查找对应糖含量，即得乳酸菌胞外多糖产量。

1.2.5 提取纯化工艺流程斜面→MRS液体培养基活化两次（37℃，24h）→摇床扩大培养（37℃，150r/min，24h）→离心去除菌体（5mL，10000×g，8min）→添加三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心沉淀除蛋白（4℃，18000×g，30min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍体积，4℃，处理12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻干燥→沉淀温水溶解（稀释10倍）→透析MD34（4℃，处理12h）→苯酚-浓硫酸法测定OD值→EPS纯度鉴定2 结果与分析2.1 苯酚硫酸法标准曲线绘制用葡萄糖作为标准物，绘制标准曲线。

由图1可知，糖浓度在0～32mg/L时，糖浓度和透光度呈线性关系。

葡萄糖浓度（mg/L）OD值（49nm）图1 Phenol-H2S04法测定糖浓度的标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of sugar concentration by Phenol- H2S04 method1011022.2 除蛋白条件优化2.2.1 除蛋白中三氯乙酸浓度的优化将发酵液通过离心的方法除去菌体后，分别加入30%、40%、50%的三氯乙酸溶液1/5体积，探讨不同三氯乙酸浓度对蛋白质沉淀的影响，如图2所示。

三氯乙酸浓度在30%～50%时与发酵液多糖产量呈正比关系，三氯乙酸浓度过高会对多糖的结构产生影响，因此初步确定除蛋白阶段三氯乙酸的最优浓度为50%。

2.2.2 除蛋白中离心力优化本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，分别在10000×g 、12000×g 、13000×g 、16000×g 离心力下离心30min ，选取最优化离心条件，如图3所示。

在离心力16000×g 时，多糖得率达到最大值，选16000×g 为最优离心力。

三氯乙酸浓度（%）E P S 含量（m g /L ）图2 三氯乙酸浓度对胞外多糖产量的影响Figure 2 Effect of trichloroacetic acid concentration onthe yield of extracellular polysaccharides380.00360.00340.00320.00离心力（×g ）E P S 含量（m g /L ）图3 离心力对胞外多糖产量的影响Figure 3 Effect of centrifugal force on the yield ofextracellular polysaccharides 2.2.3 除蛋白质中离心时间的优化本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g 的离心力下分别离心10min 、20min 、30min 、40min ，选取最优化离心时间，如图4所示。

离心的时间选取30～40min 为最佳。

2.3 乙醇沉淀多糖条件的优化2.3.1 乙醇沉淀多糖中乙醇浓度的优化本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g 的离心力下分别离心40min ，加入3倍体积浓度分别为70%、80%、95%、100%的乙醇溶液，4℃条件下醇沉12h 。