子宫颈癌中CD147蛋白和MMP-9+mRNA的表达及意义

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤｌ４７ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｆｕｒ－ ｔｈｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅａｌ ＭａｘＶｉｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＲＴ·－ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤｌ４７ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｂｏｔｈ １０ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎ—－ ｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ４０ ｅａｓｅｓ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅａｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤＩ ４７ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｅｙ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｔｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤｌ４７ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｆｌａｍ—
收稿日期：２００７—０７—３０修回日期：２００７一ｌｌ一０６ 基金项目：江西省卫生厅基金资助（０４０３３７） 作者单位：南昌大学医学院病理学教研室，南昌３３０００６ 作者简介：俞薇薇．女，副教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤病理学。
Ｔｅｌ：（０７９１）６３６０５６０，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｅＵｏｙｕ＠１２６．ｃｏｍ
积２５止的反应体系。ＰＣＲ反应条件：９４ ｏＣ×３ ｍｉｎ ｄ．９４℃×１ ｍｉｎ，５８℃×１ ｍｉｎ，７２ ｃｃ×１．５ ｍｉｎ，共 ４０个循环。
ＰＣＲ扩增后取８“ｌ扩增产物，进行１％琼脂糖 凝胶电泳对扩增产物进行凝胶电泳分析。紫外灯下 观察结果、拍照，将图片输入计算机，采用图像分析 软件Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌ，分别读取目的电泳条带和内参Ｂ． ａｃｔｉｎ条带的平均灰度扫描值，从而得出目的条带灰 度值与内参条带灰度值的比值。对于每个目的条带 同时测量３次，最后以３个比值的均值作为该目的 条带所代表的单个样本中ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ的相对表 达量。 １．５统计学处理利用ＳＰｓＳｌｌ．５软件包进行数据 统计分析处理。ＲＴ—ＰＣＲ测得的ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ的相 对表达量和免疫组化ＣＤｌ４７表达的光密度结果在 各分组间都用均数±标准差表示，各表达指标的组 间差异在进行方差齐性检验后，采用ｔ检验或近似ｔ 检验；ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ的相对表达量和免疫组化 ＣＤｌ４７光密度值两者间相关性采用Ｐｅａｒｓｏｎ相关分 析进行统计学处理。
子宫颈癌是影响女性健康的常见恶性肿瘤，其 发病率呈逐年增加且伴有年轻化趋势。尽管子宫颈 癌的治疗现大有改善，但仍然有多数患者因癌的浸 润和转移导致易复发，预后不良。近年来，人们在肿 瘤侵袭转移机制及抗侵袭转移领域进行了广泛研 究，发现基质金属蛋白酶－９（ＭＭＰ－９）能降解细胞外 基质和基底膜中的主要成分Ⅳ型胶原，使肿瘤细胞 突破原发部位而发生侵袭和转移。ＣＤｌ４７是新发现
淋巴转移组高于无转移组（Ｐ＜０．Ｏｌ、Ｐ＜０．０５）；ＣＤｌ４７蛋白在宫颈鳞状细胞癌低分化组表达与中分化组表达差异无显著性（Ｐ
＞０．０５），但ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ表达为低分化组高于中分化组（Ｐ＜０．０５）。结论ＣＤｌ４７蛋白和ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ在子宫颈鳞状细胞
癌中呈高表达，它们之间的表达具有正相关性，二者可能共同参与了子宫颈鳞状细胞癌的侵袭和转移过程。
关键词：子宫颈肿瘤；鳞状细胞癌；ＣＤｌ４７；基质金属蛋白酶－９；免疫组织化学；ＲＴ·ＰＣＲ
中图分类号：Ｒ ７３７．３３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１—７３９９（２００８）０２—０１７０一０４
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＣＤｌ４７ ａｎｄ ＭＭＰ．９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｃｅｒｖｉｘ
ＢＡ． 删ａＣｃ和ｔｉＣｎ作 Ｔ（为、对ＴＣ照Ｃ，ＣＴ其ＧＴ引Ａ物 ＴＧ序ＣＣ列ＴＣ为ＴＡＧＴ，ＧＴＭＣＭＡＣＰＧ＿Ｃ９Ａ经ＣＧ
ＰＣＲ扩增片段大小为５３ｌ ｂｐ，ｐ—ａｃｔｉｏｎ为２１８ ｂｐ。 １．４．２ 总ＲＮＡ提取按石蜡包埋组织核酸提取专 用试剂盒说明的方法提取石蜡组织中的总ＲＮＡ。 １．４．３ ＲＴ—ＰＣＲ扩增ｃＤＮＡ合成：取ＲＮＡ溶液１０ 一，加入，ＯｌｉｇｏｄＴ ２ ｐ．１，７５ ｏＣ水浴５ ｍｉｎ，继续加人 ＤＥＰＣ ５“ｌ，５×ｂｕｆｆｅｒ ５ ｕ１，Ｒｎａｓｉｎ ０．５山，ＤＮＴＰ １．５山，Ｍ—ＭｕＬＶＲＴ ｌ山，建立２５斗ｌ逆转录反应体， 稍离心，３７℃水浴ｌ ｈ合成ｃＤＮＡ。ＭＭＰ－９扩增：取 ＤＥＰＣ １３斗ｌ，ｃＤＮＡ ２山，ＭＭＰ－９上游引物ｌ斗ｌ， ＭＭＰ－９下游引物ｌ斗ｌ，２×Ｔａｑｐｃｒ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ ８斗ｌ，构 建为总体积２５“ｌ的反应体系。Ｂ—ａｃｔｉｎ扩增：ＤＥＰＣ １３山，ｃＤＮＡ ２山，１３－ａｃｔｉｎ上游引物１斗ｌ，ｐ—ａｃｔｉｎ下 游引物１山，２×Ｔａｑｐｃｒ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ ８山，构建为总体
ＭａｘＶｉｓｉｏｎ法、ＲＴ．ＰＣＲ技术检测ｌＯ例慢性子宫颈炎组织（对照组）和４０例子宫颈鳞状细胞癌患者的外科手术切除标本组织
中ＣＤｌ４７蛋白、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ的表达，应用图像分析软件分别对ＣＤｌ４７和ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ的表达进行平均光密度和灰度分析。
结果ＣＤｌ４７蛋白和ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ的表达结果显示：子宫颈鳞状细胞癌组高于对照组慢性子宫颈炎组织（Ｐ值均＜０．０１）；有
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临床与实验病理学杂志Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ ２００８ Ａｐｒ；２４（２）
子宫颈癌中ＣＤｌ４７蛋白和ＭＭＰ一９ ｍＲＮＡ的表达及意义
俞薇薇，宋恩霖，艾有生，熊小亮，刘繁荣，鄢敏
摘要：目的探讨ＣＤｌ４７蛋白、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ在子宫颈鳞状细胞癌中的表达及其与侵袭、转移的关系。方法 采用免疫组化
ｍａｔｉｏｎ ｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０１）；ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ Ｗａｓ ａｌｓｏ ｃｌｅａｒｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（Ｐ＜０．０１。Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅ Ｗａｓ ｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖ— ｅｌ ｏｆ ＣＤｌ４７ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５），ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｌｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤｌ４７ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｂｏｔｈ ＣＤｌ４７ ａｎｄ ＭＭＰ－９ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｊｏｉｎｔｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｅｒｖｉｘ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＣＤｌ４７；ＭＭＰ－９；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＲＴ－ＰＣＲ
广泛存在于人体各个组织器官的糖蛋白，属于免疫 球蛋白超家族（ＩｇＳＦ），最新的研究认为它高表达于 多种肿瘤，并可通过多种途径诱导ＭＭＰｓ的释放从 而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。我们运用ＲＴ－ ＰＣＲ、免疫组织化学技术观察ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ和 ＣＤｌ４７在子宫颈癌的表达及与肿瘤侵袭和转移的关 系。
１材料与方法
有淋巴结转移的病例１８例，无淋巴结转移者２２例； 低分化鳞状细胞癌２５例，中分化鳞状细胞癌１５例。 所有标本术前皆未行放、化疗或其他特殊治疗。另 取慢性子宫颈炎标本１０例作为对照组。 １．２试剂所用试剂为石蜡包埋组织核酸提取专 用试剂盒（编号ＡＭ．１９７５），ＭＭＰ－９引物、Ｂ—ａｃｔｉｎ引 物、Ｎｕｃｌｅａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ均购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；兔抗 人ＣＤｌ４７多克隆抗体（产品编号ＺＡ－０４５５，浓缩型 ０．１ｍ１），ＭａｘＶｉｓｉｏｎ二抗试剂盒（购自福州迈新公 司）。 １．３免疫组化染色检测 采用ＭａｘＶｉｓｉｏｎ一步法 标记ＣＤｌ４７抗体，工作浓度为ｌ：５０，用ＥＤＴＡ沸液 热修复组织抗原，ＤＡＢ显色，苏木精复染，中性树胶 封固。以试剂公司提供的阳性切片为阳性对照，以 ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照。ＣＤｌ４７以细胞质和 （或）细胞膜呈棕黄色颗粒为阳性。切片在光镜下， 按统一放大倍数（×４００），选取肿瘤区阳性表达最 强的５个高倍视野，进行数码拍照，并输入图像分析 软件Ｉｍａｇｅ．Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．０中，准确分割出阳性区域 后，测量单位光学密度值（Ｍｅａｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ）。在相同 条件下，每个图片测量３次，以所得３个光密度值的 均数作为该图片视野中ＣＤｌ４７的表达强度。最后 再以同一切片的５个视野各自测得的平均光密度值 的均数作为该切片所代表的单样本的ＣＤｌ４７的表 达强度。 １．４ ＲＴ－ＰＣＲ检测 １．４．１ 引物设计 ＭＭＰ－９引物参考文献［１］，引物 序列为ＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧ和ＣＡＡＡＣＣ ＧＡＧｒＩ．Ｉ’ＧＧＡＡＣＣＡＣ，并经ｂｌａｓｔ进一步验证。选用