转基因植物生产疫苗和药物的研发进展

转基因植物生产疫苗和药物的研发进展天然来源的药用蛋白往往因提纯成本高而导致价格昂贵，疫苗和重组蛋白则需建立人工表达系统来生产。

传统的生产方式主要包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞等系统，但这些方式都有各自的缺点，如微生物细胞无法对蛋白进行哺乳动物的糖基化修饰或正确的折叠组装，动物细胞表达系统成本高且有污染病原的风险等。

理想的蛋白表达系统必须能生产有功能的产物、生产成本低、产物易于纯化、生产耗时短。

近年来，转基因植物表达药用蛋白（Plant-made pharmaceuticals，PMP）的新技术平台获得了广泛关注［1］。

1 转基因植物生产疫苗和药物研发概述与其他几种表达系统相比，以转基因植物作为生物反应器生产重组蛋白被认为具有突出优点：方法简单、成本低廉、易于规模化生产、储藏和运输方便等，既能对表达蛋白进行翻译后折叠和糖基化修饰，与通常使用的哺乳细胞、大肠杆菌、酵母表达系统相比，又没有污染人类病原或毒素的风险，成为表达药用蛋白的理想选择［2］。

1986年研究者将人生长激素基因引入烟草，获得了表达产物，从此开启了PMP的研发工作。

1989年研究者首次在烟草中成功表达了人免疫球蛋白G （IgG），证明植物中能够合成并正确组装这种多亚基的糖蛋白。

首先实现商业化生产的PMP是以色列药品研发公司Protalix开发的在胡萝卜细胞中表达的葡糖脑苷脂酶，于2012年美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，用于治疗β-葡萄糖脑苷脂酶减少或缺乏引起的一种遗传代谢病——高雪氏病（Gaucher’s disease），其价格要比天然来源的药物更便宜。

在植物可食部分表达疫苗（被称为“可食疫苗”或“口服疫苗”，Edible vaccines）是PMP领域的研发热点之一。

传统疫苗生产和纯化过程较为复杂和昂贵，在运输和储存过程中必须冷藏，注射免疫的方式进一步增加了成本，需要专业人员进行注射接种，存在交叉感染的风险，具有潜在的安全性问题。

用转基因植物生产疫苗则具有可当地种植、常温储藏的天然优势，将免去或部分免去蛋白纯化的花费，摒弃注射方式，也不存在弱毒疫苗毒性恢复的潜在风险。

更为重要的是，“可食疫苗”食用后可同时引起粘膜免疫反应与血清免疫反应。

在消化道内，植物细胞壁能够保护疫苗抗原不被消化酶降解，直到肠道微生物降解植物细胞壁后，抗原被释放出来，引发免疫反应。

表达疫苗或药用蛋白的植物细胞在冻干后可在室温保存多年，是产生黏膜免疫的经济可行的方法。

将抗原决定簇蛋白与穿黏膜载体（如霍乱毒素B亚基，CTB；大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基，LTB）融合表达，重组蛋白能够有效地穿过肠道上皮细胞而进入循环或免疫系统，可提高抗原运送至免疫系统的效率，促进了口服疫苗的研发［3］。

2 几种主要的表达技术系统2.1 转基因植株表达通过农杆菌介导、基因枪等方法将外源基因整合入植物细胞核，可使外源重组蛋白质连续稳定合成。

根据信号肽的有无，表达蛋白可以存储在不同的细胞器内或分泌至胞外。

这种表达方式的优点是蛋白质能够进行完整的翻译后修饰，但外源基因容易受到基因沉默、位置效应（外源基因的表达因插入位置不同而变化的现象）等的影响，表达量较低，存在转基因安全性的问题。

在目前研发的产品中，主要受表达量低的因素限制，还没有通过临床一期试验的例子。

通过位点特异性同源重组，将外源基因插入植物叶绿体基因组中，可使目标蛋白在叶绿体内积累。

植物细胞中叶绿体基因组的数量可达上万拷贝，这可极大提高外源基因的表达量。

例如，在叶绿体基因组中引入人生长激素基因时，表达量能达到细胞核转化的百倍以上；通过遗传改造的表达系统，表达量甚至可高达可溶性蛋白总量的72%［4］。

引入叶绿体基因组的外源基因没有核转基因中经常发生的位置效应，也不会发生基因沉默。

在开花前收获植株，能够防止通过花粉或种子发生转基因漂移。

采用多顺反子表达的策略，用一个启动子能够表达多个外源基因。

脊髓灰质炎、疟疾、肺结核、轮状病毒、猪流感等多种病毒的抗原都在叶绿体中成功获得了高表达［5］。

2.2 瞬时表达以农杆菌接种法（Agroinoculation）或农杆菌渗入法（Agroinfiltration）介导基因瞬时表达是近年来发展起来的表达技术，是植物遗传转化与植物病毒学技术的融合。

首先构建携带病毒表达载体的农杆菌T-DNA，通常利用花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等作为载体，将重组蛋白基因与病毒衣壳蛋白融合，或用衣壳蛋白启动子启动重组蛋白基因。

通过植物叶片气孔注射或真空渗入的方法，使农杆菌进入植物叶片细胞间隙，借助农杆菌侵染作用使病毒DNA载体有效运输到植物细胞中。

病毒载体在植物细胞中大量复制，几天之内就能表达大量的外源蛋白，最高表达量可达总可溶蛋白的27.6%。

采用农杆菌渗入法瞬时表达可提高表达量，显著缩短植物处理过程，降低下游成本［6，7］。

以病毒基因组为框架的表达载体构建是瞬时表达技术系统的关键。

烟草花叶病毒和马铃薯X病毒载体能够实现外源基因的大量表达，但由于是RNA病毒，导致同时表达多个蛋白的效率较低；双生病毒载体表达系统能够表达较大的外源蛋白；烟草脆裂病毒载体表达系统适用于基因沉默和在植物根部表达。

随着未来研发的深入，将有望创造出融合不同优点的新的病毒表达载体。

2.3 悬浮细胞表达将农杆菌转化形成的植株或植物愈伤组织细胞制备成悬浮细胞，能够较为容易的在发酵罐中进行扩大生产。

2006年美国农业部批准的第一例禽用新城疫病毒疫苗就采用了烟草悬浮细胞表达系统。

2012年FDA批准的首例人用药用蛋白——葡糖脑苷脂酶是就在胡萝卜细胞中表达的。

此外，还在水稻悬浮细胞中获得了表达量为5.1 μg/mg的猪流感病毒E2糖蛋白，口服后可引发小鼠和猪的黏膜免疫与细胞免疫反应。

但以该系统生产的产品仍需经过较为复杂的下游纯化过程和低温无菌储存运输，其成本相对较高，并没有完全发挥出植物生物反应器的优越性。

3 转基因植物表达疫苗与药用蛋白的代表性研发案例迄今为止，一批重组抗体、抗原、疫苗、医用或药用蛋白都在转基因植物中获得了表达。

除烟草外，生菜、番茄、胡萝卜、大豆、马铃薯、苜蓿、水稻及玉米等植物常被用作表达系统［8］。

3.1 疫苗首例植物来源的口服疫苗早在1995年即研发成功，是在烟草和马铃薯中表达的大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基LTB，饲喂小鼠后能够引起血清IgG和分泌型IgA合成。

此后，马铃薯块茎表达的诺如病毒衣壳蛋白VP1、马铃薯和玉米表达的大肠杆菌毒素疫苗、水稻表达的霍乱疫苗等都进入了临床一期试验，在被试者体内引发了血清免疫。

美国陶氏益农（Dow AgroSciences）公司研发的新城疫疫苗2006年获得USDA许可，是获得许可的第一个植物来源疫苗，然而并没有实现商业化生产。

流感病毒血凝素（HA）抗原变异率高，使流感成为威胁世界公共健康最重要的疾病之一。

HA是流感病毒表面的糖蛋白，在病毒感染和致病性方面起着关键作用，也是引起宿主体内保护性免疫反应的主要抗原。

高致病性禽流感H5N1毒株不仅在家禽中引起大流行，也严重威胁全球人类健康。

为预防畜禽传染性疾病爆发，通常需要进行大规模的免疫接种，植物来源的疫苗为控制禽流感提供了理想的解决方案。

在拟南芥中表达禽流感H5N1毒株的HA，可获得140 μg/g 鲜重的高表达量。

叶片冻干后与免疫助剂同时饲喂小鼠，不仅能诱导合成HA特异性的IgA和IgG，还能产生中和抗体并引发细胞免疫反应，显示出良好的免疫保护效果［4］。

美国Medicago公司生产的H5N1型禽流感疫苗已完成临床二期试验。

在一种转基因牧草Stylosanthes guianensis中表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1，将植物原料作为饲料添加剂饲喂小鼠，首次实现了针对口蹄疫的口服免疫。

也有研究者在转基因水稻、烟草、番茄、苜蓿及其他牧草植物中表达口蹄疫病毒的衣壳前体多肽，成功引发了口服免疫反应。

在番茄根毛系统中表达的狂犬病毒核蛋白能够在小鼠中引发免疫反应，并对病毒产生抗性；利用苜蓿花叶病毒瞬时表达体系，采用农杆菌渗入法在菠菜中瞬时表达的狂犬疫苗进入临床一期试验，能够在被试者体内产生中和抗体。

植物表达口服疫苗目前面临的主要技术问题是免疫耐受。

常规注射用疫苗通常要同时使用免疫刺激的助剂，但口服疫苗由于缺乏免疫刺激而影响免疫效果，或产生免疫耐受。

不过从另一个方面来看，抗原引起的特异性免疫耐受则为抗过敏口服疫苗提供了一个新的技术途径。

将日本雪松（Japanese cedar）花粉过敏原Cry j1和Cry j2基因在水稻胚乳中表达，给花粉过敏的小鼠饲喂转基因稻米，在体内引发免疫耐受，能够抑制特异性的抗原IgE和细胞因子反应，血清中的组胺合成和打喷嚏等症状也得到抑制，表现出抗过敏的效果。

然而，自首例植物来源的口服疫苗诞生20余年来，尚没有一个产品实现产业化应用。

3.2 抗体欧洲科学家在转基因烟草中表达了中和人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的人单克隆抗体2G12，欧盟以2G12作为案例，通过了植物生产重组药用蛋白的标准化生产规程，包括植物转化与筛选、种子库构建、遗传稳定性的保证、植株均一性、种植与收获等。

德国批准了该转基因抗体的临床一期试验，并未发现明显的安全问题。

这是首例获准进入临床试验的转基因植物表达的单克隆抗体，是PMP商业化进程中里程碑式的事件。

埃博拉病毒引起的埃博拉出血热是死亡率很高的烈性传染病。

美国Mapp 公司研发了一种名为ZMapp 的试验性生物药物，以转基因烟草表达的3种抗埃博拉病毒的人鼠嵌合单克隆抗体mAbs进行“鸡尾酒”疗法。

2014年8月在线发表于《Nature》上的一项研究论文中指出，ZMapp治愈了全部18只感染埃博拉病毒的恒河猴；在尚未开展临床试验的情况下，同年在利比里亚治愈了2名感染病毒的美国医疗援助人员，为抗埃博拉药物研发带来了希望。

3.3 其他药物蛋白许多医用或药用蛋白都在转基因植物中成功表达，包括人生长激素、血清白蛋白、血红蛋白、α-干扰素、白介素、促红细胞生成素、胰蛋白酶抑制剂等。

生菜被认为是生产PMP的理想植物。

在转基因生菜中表达与CTB融合的凝血因子9，在人工控制的环境和条件下生长，收获生菜叶片后进行冻干，可获得约1 mg/g的高表达量。

融合蛋白折叠和翻译后修饰正确，在室温可保存约2年，饲喂小鼠能够有效地引发特异性免疫反应。

Griffithsin（GRFT）是一种来源于红色海藻、由121个氨基酸组成的外源凝集素，由于具有针对HIV的抗病毒活性而被当做治疗艾滋病的候选药物。

GRFT 在大肠杆菌中获得了成功表达，但对于藻类蛋白来说，植物细胞是更为适宜的表达系统。