植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达柴化建;赵海泉;张丽君;罗焕亮【摘要】旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达.以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段.构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coli BL21( DE3).筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定.PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功.经IPTG诱导BL21( pET-28a(+)-Imp)表达约20kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在.结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coli BL21( DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】5页(P106-110)【关键词】植原体;免疫主导膜蛋白;原核表达【作者】柴化建;赵海泉;张丽君;罗焕亮【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,合肥230036;安徽农业大学生命科学学院,合肥230036;深圳市职业技术学院,深圳518055;深圳出入境检验检疫局,深圳518045【正文语种】中文植原体（phytoplasma）是一种存在于植物韧皮部筛管细胞中类似植物病原细菌的单细胞原核生物［1］。

植原体对植物危害严重，可引起植物黄化、小叶、皱叶及丛枝等，因其侵染性强，危害寄主广泛，目前尚无根治方法，易造成严重的经济损失［2］。

由于植原体不能够体外培养，难以获得大量高纯度的植原体，制约了植原体检测防控、致病机制及流行性等研究［3］。

因致病植原体无细胞壁，所以植原体可能通过分泌膜蛋白直接接触寄主而致病。

以此推测植原体膜蛋白在寄主与植原体相互作用过程中起着重要的作用。

现在对于植原体膜蛋白的研究主要集中于植原体的免疫膜蛋白和Sec（蛋白转运系统）膜蛋白［4，6］。

其中免疫膜蛋白（immunodominant membrane proteins，IDPs）是大多数植原体总细胞膜蛋白的主要部分［7，8］。

通过基因对比分析，免疫膜蛋白IDPs可分成3种类型：（1）免疫主导膜蛋白（immunodominant membrane protein，Imp）；（2）免疫主导膜蛋白A（immunodominant membrane protein A，IdpA）；（3）免疫抗原膜蛋白（antigenic membrane protein，Amp）。

其中免疫主导膜蛋白（immunodominant membrane protein，Imp）是其中重要的一种［7，8］。

Imp分子量大约为19 kD大小，分子结构由膜内侧N端、疏水跨膜的α-螺旋片段、膜外亲水的C端3部分组成［9］。

原核表达免疫膜蛋白Imp，其基因编码蛋白的跨膜结构区可能对其原核表达有一定影响［10］。

若以包涵体形式在原核细胞尤其在大肠杆菌中能够高效表达外源基因，易于毒性蛋白和膜蛋白的表达［11］。

通过对植原体膜蛋白Imp基因进行特异性扩增，设计构建合适的原核表达载体，原核表达带有6×His-Tag的目的蛋白，以纯化获得大量高纯度的植原体免疫膜蛋白Imp，用于免疫获得相应的特异性抗原抗体，以制备特异性高通量检测的蛋白质芯片，对植原体致病机理及检测研究有着重要的理论与实践意义。

本研究在前期研究的基础上构建Imp原核表达载体，并获得初步诱导表达结果，旨在为后续诱导纯化Imp及制备抗Imp单克隆抗体奠定基础。

1.1.1 菌株与载体大肠杆菌E.coli BI21（DE3）、原核表达载体pET-28a（+）、重组克隆质粒pMD18-T-Imp均由本实验室构建保存。

1.1.2 酶类及主要试剂限制性内切酶Nde I和Xho I购于NEB公司；PCR Master Mix、T4 DNA连接酶购于大连宝生公司；DNA Marker、小规模质粒提取试剂盒、琼脂糖胶DNA纯化回收试剂盒均购自北京索莱宝公司；BugBuster Master Mix预混蛋白抽提试剂购自Novagen公司。

其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2.1 引物设计从GenBank中检索到已公布的植原体免疫主导膜蛋白基因Imp序列，进行引物对设计，根据表达载体pET-28a（+）特性，上游引物引入酶切位点Nde I，下游引物引入酶切位点Xho I。

上游引物F1：F'5'-acCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'，下游引物R1：R'5'-cgGAGCTCATCCA TCTCCAGTGCGGTCTCAATC-3'，引物由上海生工生物公司合成。

1.2.2 Imp基因PCR扩增及产物回收纯化以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板，利用常规PCR扩增反应进行。

反应体系50 μL：DNA模板2 μL，引物F1、R1各1 μL，Prime MIX DNA聚合酶25 μL，ddH2O 21 μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性2 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；然后72℃延伸10 min，4℃保温。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物。

1.2.3 原核表达载体的构建与鉴定将纯化的PCR产物与原核表达载体pET-28a （+）分别用Nde I、Xho I双酶切。

酶切体系25 μL：pET-28a（+）/PCR回收产物15 μL，10×H Buffer 2 μL，Nde I（10 U/μL）、Xho I（10 U/μL）各1μL，ddH2O 5 μL。

回收经T4 DNA连接酶16℃水浴连接12-16 h。

转化至CaCl2法制备的BL21（DE3）感受态细胞。

从转化平板（含Kan 40 μg/mL）上随机挑选几个转化子菌落，37℃振荡培养提取重组质粒，通过双酶切和PCR扩增的方法检测重组子，命名为pET-28a（+） -Imp（图1）。

1.2.4 重组菌E.coli BL21（pET-28a（+）-Imp）的诱导表达及鉴定挑取经鉴定的阳性单克隆，接入10 mL LB（含Kan 40 μg/mL）液体培养基中，于37℃、200 r/min过夜培养。

按1%的接种量，转接至装有50 mL LB培养基中，培养至OD600为0.5-0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，37℃继续培养4 h。

离心收集菌体，用PBS重悬。

取75 μL重悬液与25 μL 4×蛋白上样缓冲液混合，液沸水煮5 min，上样量10 μL。

进行SDS-PAGE分析，浓缩胶浓度4%，分离胶浓度9%。

1.2.5 目的蛋白可溶性分析取100 mL诱导培养液，6 000 r/min，10 min，4℃收集细胞。

用5 mL BugBuster Master Mix蛋白抽提试剂室温下振荡重悬沉淀，孵育30 min裂解菌体。

然后4℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清液，作为可溶性蛋白。

沉淀用与蛋白抽提试剂等体积的PBS重悬，作为包涵体。

以80μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液为参照，与上清、包涵体悬液进行SDS-PAGE电泳检测凝胶扫描，通过Gene Tools半定量分析可溶性蛋白与包涵体比例及含量。

以重组克隆pMD18-T-Imp为模板PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果（图2）显示，PCR产物在500 bp左右处有明显条带，与目的基因Imp （507 bp）片段大小一致。

以Nde I和Xho I双酶切重组表达质粒pET-28a（+）-Imp，并以重组质粒为模板PCR。

通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切与PCR，结果（图3）显示，酶切得到约5 369 bp的pET-28a（+）线性片段和约507 bp的插入片段。

PCR电泳（图4）显示从重组质粒上扩增到插入基因，说明Imp基因已成功插入到表达载体pET-28a（+）中。

挑取阳性克隆，诱导表达。

原核表达质粒pET-28a（+）-Imp转化至E.coli BL21（DE3），在IPTG诱导后，表达Imp融合蛋白，经9% SDS-PAGE分析鉴定（图5），可见分子量约为20 kD，与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白（19.5 kD）大小相符。

对可溶性蛋白与包涵体分离，并进行SDSPAGE电泳检测，结果显示构建于pET-28a（+）原核表达载体中的植原体免疫主导膜蛋白（Imp）基因，在宿主菌E.coli BL21（DE3）中诱导表达，目的蛋白主要以包涵体形式存在。

凝胶扫描后，以已知量的BSA为参照，通过Gene Tools半定量分析，包涵体的含量占总融合蛋白的70%以上，且背景蛋白表达量受到限制（图6）。

虽然在植原体免疫膜蛋白结构信息学方面的研究已有一定进展，但是并不足以解释其功能机制［4］。

由于植原体不可体外培养的特性，使得获得大量高纯度的植原体免疫膜蛋白变得困难，继而限制了高效价抗植原体特异性单克隆抗体的制备及植原体膜蛋白功能机制的研究。

因此，需要建立一个有效的表达系统获取目的蛋白并进行研究。

据报道免疫膜蛋白（Imp）的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达，但影响机制目前尚不清楚。

只有切除N端和C端跨膜区的Imp基因的序列才能得到了大量表达［10］。

2002年，Barbara等［6］研究到植原体免疫抗原膜蛋白基因Amp对大肠杆菌细胞有毒性。

2008年，Arashida等［11］在大肠杆菌中表达了日本八仙花变叶病植原体的免疫抗原膜蛋白基因，得到了抗JHPAmp的抗体。

由此证明在原核生物体中表达具有毒性的蛋白或膜蛋白，表达载体的构建及宿主菌的选择是实现高效表达的关键步骤。

对与毒性蛋白或膜蛋白的表达，毒性蛋白或膜蛋白的原核表达载体，启动子要有很强的启动性，使重组蛋白表达量增大，且表达必须受调节基因严格调控。

并要求能在一定菌体浓度下开始诱导表达，外源蛋白过量表达，尤其细胞毒性蛋白会严重抑制菌体生长从而降低蛋白总表达量［12］。

pET-28a（+）质粒载体，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；E.coli BL21（DE3）宿主细胞提供T7 RNA聚合酶进行诱导调控。

T7 RNA聚合酶机制十分有效并具选择性，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上，目的蛋白聚集成不溶的没有生物活性的包涵体。

形成包涵体较有利于纯化，而且毒性蛋白主要以无活性的包涵体形式表达，将减小目的蛋白表达对宿主菌的生长抑制。