3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒说明书
大学生物化学09糖代谢工
22-磷酸甘油酸 2磷酸烯醇丙酮酸
+
丙酮酸激酶
2丙酮酸
限速酶： 己糖激酶： 别构抑制剂：6-磷酸葡萄糖 丙酮酸激酶： 别构抑制剂：ATP、丙氨酸 6-磷酸果糖激酶-1 （PFK-1）
28
1、 6-磷酸果糖激酶-1 （PFK-1） • （1）ATP/AMP的调节
• （2）柠檬酸调节 • （3） 2，6二磷酸果糖调节（ F-2,6-BP）
P
C
O
磷酸二羟丙酮
3-磷酸 甘油醛
CH2OH
1,3-二磷酸甘油酸
ADP ATP
醛缩酶 (aldolase) CHO
+
CH2O
P
3-磷酸甘油酸
CH
OH
3-磷酸甘油醛
P
14
2-磷酸甘油酸
磷酸烯醇式丙酮酸
ADP
CH2 O
1,6-双磷酸果糖
丙酮酸
ATP
Glu
ATP ADP
G-6-P F-6-P
⑸ 磷酸丙糖的同分异构化
Glu
ATP ADP
G-6-P F-6-P
⑽ 磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸， 并通过底物水平磷酸化生成ATP
ATP ADP
F-1,6-2P 磷酸二 羟丙酮
NAD+ NADH+H+
3-磷酸 甘油醛
COOH C O CH2
ADP
P
K+ Mg2+
ATP
COOH C=O CH3
1,3-二磷酸甘油酸
ADP ATP
F-2,6-BP是6-磷酸果糖激酶-1 最强的变构激活剂。
30
ATP
ADP
(+)
生物化学之糖代谢(唐炳华)
CH2 OH
H OH H
OH
H OH
葡萄糖
P O CH2
ATP
ADP
Mg2+
H H
OH
己糖激酶
OH H
HO
OH
(hexokinase)
H OH
6-磷酸葡萄糖
(glucose-6-phosphate,
2-磷酸甘油酸
G-6-P)
磷酸烯醇式丙酮酸
ADP
ATP
丙酮酸
哺乳类动物体内已发现有4种己糖激酶同 工酶，分别称为Ⅰ至Ⅳ型。肝细胞中存在的 是Ⅳ型，称为葡萄糖激酶(glucokinase)。它的 特点是：
3-磷酸甘油醛脱氢酶
HC OH
CH2 O P 1,3-二磷酸
甘油酸
2-磷酸甘油酸
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
磷酸烯醇式丙酮酸
ADP
ATP
丙酮酸
Glu
ATP
ADP
G-6-P
⑺ 1,3-二磷酸甘油酸转变成3-磷酸甘油酸
F-6-P
ATP
O = C O P ADP
ATP
COOH
ADP
F-1,6-2P
HC O H
磷酸甘油酸激酶
HC OH
CH2 O P
CHБайду номын сангаас O P
磷酸二 3-磷酸 羟丙酮 甘油醛
NAD+
1,3-二磷酸 甘油酸
3-磷酸甘油酸
NADH+H+
1,3-二磷酸甘油酸
磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)
ADP ATP
3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)试剂盒说明书
货号：MS2205 规格：100管/96样3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书微量法正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
测定原理3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3 二磷酸甘油酸。
GAPDH逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH 活性的高低。
需自备的仪器和用品分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；试剂三：液体×1 支，4℃保存；样本的前处理1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10分钟；现配现用。
糖脂代谢通路主要代谢酶类及中间产物中英文对照
11
丙酮酸激酶
Pyruvate kinase
12
乳酸脱氢酶
Lacate dehydrogenase
糖异生途径
13
丙酮酸羧化酶
Pyruvate carboxylase
14
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶
Phosphoenolpyruvate carboxykinase
15
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
Phosphoenolpyruvate carboxylase
Alcohol dehydrogenase
14
乙醛脱氢酶
Aldehyde dehydrogenase
15
线粒体甲基戊二酰辅酶A合成酶
Mitochondrical HMG-CoA synthase
酮体代谢
16
甲基戊二酰辅酶A裂解酶
—hydro—-methylglutaryl CoA lyase
17
—羟丁酸脱氢酶
NADPH
10
甘油
glycerol
甘油脂代谢
11
甘油—3-磷酸
glycerol-3-phosphate
12
鲨烯
squalene
胆固醇合成
13
胆固醇
cholesterol
6
丙糖磷酸异构酶
Triose phosphate isomerase
7
甘油醛磷酸脱氢酶
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
8
磷酸甘油酸激酶
Phosphoglycerate kinase
9
磷酸甘油变位酶
Phosphoglycerate mutase
生物化学糖试题集及答案
生物化学糖试题集及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 糖酵解过程中，下列哪种酶催化的反应不可逆？A. 己糖激酶B. 磷酸果糖激酶-1C. 丙酮酸激酶D. 乳酸脱氢酶答案：C2. 糖酵解过程中，哪种物质是限速酶？A. 己糖激酶B. 磷酸果糖激酶-1C. 丙酮酸激酶D. 乳酸脱氢酶答案：B3. 糖酵解过程中，哪种物质是关键的调节因子？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A4. 糖酵解过程中，哪种物质是最终产物？A. 丙酮酸B. 乳酸C. 二氧化碳和乙醇D. 葡萄糖-6-磷酸答案：B5. 糖酵解过程中，哪种物质是丙酮酸激酶的激活剂？A. 柠檬酸B. 丙酮酸C. 果糖-1,6-二磷酸D. 葡萄糖-6-磷酸答案：C6. 糖酵解过程中，哪种物质是丙酮酸激酶的抑制剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A7. 糖酵解过程中，哪种物质是己糖激酶的抑制剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A8. 糖酵解过程中，哪种物质是磷酸果糖激酶-1的抑制剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：A9. 糖酵解过程中，哪种物质是磷酸果糖激酶-1的激活剂？A. ATPB. NADHC. 柠檬酸D. 丙酮酸答案：C10. 糖酵解过程中，哪种物质是乳酸脱氢酶的底物？A. 丙酮酸B. 乳酸C. 果糖-1,6-二磷酸D. 葡萄糖-6-磷酸答案：A二、填空题（每题2分，共20分）1. 糖酵解过程中，_________是第一个限速步骤。
答案：己糖激酶2. 糖酵解过程中，_________是第二个限速步骤。
答案：磷酸果糖激酶-13. 糖酵解过程中，_________是第三个限速步骤。
答案：丙酮酸激酶4. 糖酵解过程中，_________是最终产物。
答案：乳酸5. 糖酵解过程中，_________是丙酮酸激酶的激活剂。
答案：果糖-1,6-二磷酸6. 糖酵解过程中，_________是丙酮酸激酶的抑制剂。
3磷酸甘油醛脱氢酶糖无氧氧化
3磷酸甘油醛脱氢酶糖无氧氧化（最新版）目录1.3-磷酸甘油醛脱氢酶简介2.糖无氧氧化过程3.3-磷酸甘油醛脱氢酶在糖无氧氧化中的作用4.3-磷酸甘油醛脱氢酶的应用5.结论正文3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，简称 GAPDH）是一种参与糖酵解途径的酶，主要作用是在细胞溶酶体内进行氧化还原反应。
糖无氧氧化是一种在无氧条件下将葡萄糖分解为乳酸或酒精和二氧化碳的过程，这一过程在生物体内有着重要的生理意义。
本文将从 3-磷酸甘油醛脱氢酶的角度，探讨糖无氧氧化的过程及其应用。
在糖无氧氧化过程中，葡萄糖首先被磷酸化为葡萄糖 -6-磷酸（G6P），然后转化为果糖 -6-磷酸（F6P），接着果糖 -1,6-双磷酸（F1,6BP）产生，这个过程需要消耗一个 ATP 分子。
随后，F1,6BP 裂解为两个三磷酸甘油醛（3-phosphoglyceraldehyde，3-PGAL），此时 3-磷酸甘油醛脱氢酶发挥作用，将一个 3-PGAL 转化为磷酸二羟基丙酮酸（DHAP），同时产生一个 ATP 分子。
然后，DHAP 通过一系列反应转化为丙酮酸，最后生成乳酸或酒精和二氧化碳。
3-磷酸甘油醛脱氢酶在糖无氧氧化过程中起到了关键作用，它将一个不稳定的化合物 3-PGAL 转化为稳定的 DHAP，同时产生一个 ATP 分子，为细胞提供了能量。
此外，3-磷酸甘油醛脱氢酶还有其他功能，例如参与氧化应激反应、调控细胞生长等。
3-磷酸甘油醛脱氢酶在生物体内有着广泛的应用。
首先，由于其在糖无氧氧化过程中的关键作用，3-磷酸甘油醛脱氢酶可以作为研究糖酵解途径的重要靶点。
其次，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性可以作为评估细胞状态的指标，例如在缺氧、氧化应激等条件下，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性会发生变化。
最后，3-磷酸甘油醛脱氢酶还可以应用于生物医学领域，例如在肿瘤诊断、评估治疗效果等方面有着潜在的应用价值。
糖酵解TCA
底物水平磷酸化：是指ATP的形成直接与一个代谢 中间物（如PEP）上的磷酸基团转移相偶联的作用 。14 磷酸烯醇式丙酮酸
磷 酸 基 团
12 10
3-磷酸甘油 酸磷酸
～P ～P
转8
移 能
6
4
2
0
磷酸肌酸（磷酸基团储备物）
（二）二糖的酶促降解
二糖酶，主要有麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶 等，它们都属于糖苷酶。
存 在：广泛分布于植物、动物小肠液、微 生物中。
二、葡萄糖的分解代谢
（一）葡萄糖的主要代谢途径及细胞定位 （二）糖酵解（EMP） （三）丙酮酸的去路：无氧降解和有氧降解途径 （四）三羧酸循环（TCA） （五）乙醛酸循环
H2O
Mg或Mn
烯醇化酶
（6）甘油醛-3-磷酸氧化成1，3-二磷酸甘油酸
这是酵解中唯一的一步氧化反应
（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
甘油醛-3-磷酸＋NAD＋＋H2O→3-磷酸甘油酸＋NADH+2H＋
（7）1，3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸
atp的生成nadnadhhpiadpatp甘油醛3磷酸脱氢酶磷酸甘油酸激酶磷酸甘油酸变位酶peph2omg或mn烯醇化酶atpadp丙酮酸丙酮酸激酶6甘油醛3磷酸氧化成13二磷酸甘油酸6甘油醛3磷酸氧化成13二磷酸甘油酸这是酵解中唯一的一步氧化反应这是酵解中唯一的一步氧化反应glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase甘油醛3磷酸nadh2o3磷酸甘油酸nadh2h713二磷酸甘油酸生成3磷酸甘油酸713二磷酸甘油酸生成3磷酸甘油酸这步反应是酵解中第一次产生atp的反应phosphoglyceratekinasep1214磷酸酸基团转移能磷酸烯醇式丙酮酸磷酸肌酸磷酸基团储备物底物水平磷酸化
基因表达的半定量PCR检测
基因表达的半定量PCR检测实验目的：以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。
实验原理：真核细胞含有三类基本RNA：核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。
其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。
Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的cDNA进行聚合酶链式反应扩增。
由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。
PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。
该技术模拟体内天然DNA的复制过程。
其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。
PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。
PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。
①变性（denaturation）（95℃）；②退火(annealing)；③延伸(elogation)（72℃）图3-1 PCR扩增DNA原理示意图图3-2PCR实验中各种组分的剂量：（1）dNTP常用浓度为20~200μM，不能低于10~15μM。
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货号：MS2205 规格：100管/96样
3-磷酸甘油醛脱氢酶
(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
测定原理：
3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。
GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。
自备实验用品及仪器：
分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；
试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体14uL×1支，4℃保存；
组织样本的前处理：
①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g 离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。
建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。
细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
第1页，共2页
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本、5μL试剂三和190μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
GAPDH活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=2.572×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=2572×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V样÷V样总) ÷T=5.144×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm;d：96孔板光径,0.5cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
第2页，共2页。