植物透射电镜样品制备

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植物透射电镜样品制备

3.3 毛竹
毛竹根、毛竹根、茎、叶片的细胞壁坚硬密集，叶片的细胞壁坚硬密集，药物难以渗透，细胞腔大，药物难以渗透，细胞腔大，样品容易吸收二氧化碳并造成污染，氧化碳并造成污染，在超薄切片样品制备中属于难度很大的样品。采用常规制备方法时，属于难度很大的样品。采用常规制备方法时，极易出现切片颠痕、极易出现切片颠痕、严重污染和难以观察到细胞内部结构的现象。细胞内部结构的现象。我们采用该方法制备出了40多个竹叶样品， 40多个竹叶样品出了40多个竹叶样品，取得了较为一致的理想效果。想效果。
ห้องสมุดไป่ตู้
图4为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面，可见片为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面，面平整、无污染、整体结构保存良好。面平整、无污染、整体结构保存良好。图5、图6为叶绿体的全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富，的全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富，结构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。
4.4
1
材料
1.1 杂种鹅掌楸花粉，南京林业大学校园内杂种鹅掌楸花粉，随机取样，浸入3%的戊二醛固定。 3%的戊二醛固定随机取样，浸入3%的戊二醛固定。拟南芥，南京农业大学提供， 1.2 拟南芥，南京农业大学提供，采摘后即时浸入3%的戊二醛固定。 3%的戊二醛固定时浸入3%的戊二醛固定。毛竹，江苏大学提供， 1.3 毛竹，江苏大学提供，取样后即时浸入 3%的戊二醛固定的戊二醛固定。 3%的戊二醛固定。
4 结果
4.1 一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定，时一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定，间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，性能区别较大，在后固定时需区别对待，能区别较大，在后固定时需区别对待，对于迅速发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时，发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时，否则，会造成样品发脆，难以操作，甚至破坏掉否则，会造成样品发脆，难以操作，已保存的结构。已保存的结构。 4.2 在812树脂渗透的过程中，采用3：1；3：2；3： 812树脂渗透的过程中，采用3 树脂渗透的过程中梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。 3梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。根据植物的细胞壁厚，结构密集，植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢的特梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上，否则，点，梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上，否则，影响渗透效果。影响渗透效果。

透射电镜样品制备

包埋剂：环氧树脂（不易与乙醇相溶）固化剂：十二烷基琥珀酸酐（DDSA）和六甲酸酐（MNA）增塑剂：邻苯二甲酸二丁酯（DBP）加速剂：2、4、6-三（二甲氨基甲基）苯酚。（DMP—30）
（2）浸透、包埋具体步骤：
① 浸透： a、包埋液与环氧丙烷1：1，37℃或常温1小时。 b、包埋液与环氧丙烷3：1，37℃或常温5小时或过夜。 c、纯包埋液37℃5小时，摆床或振荡器上浸透。
② 包埋与固化：组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中固化。 37℃ 、 12 小时后，移入 45℃ ， 24 小时， 60℃，24小时。
5．超薄切片
（1）制备超薄切片的准备
1）金属载网：
耐高温，无磁性；平整；网孔大小合适，孔间距小，价格便宜。 (一般直径3mm，内有网孔200～300个)
50%→70%→80%→90%→无水乙醇（或丙酮）（2～3次）每步10～20分钟（培养细胞时间可短些，致密组织时间长些），除无水乙醇（或丙酮）在室温下进行外，其余均应在4℃下进行。
可在70%乙醇中加2%铀盐块染：电子染色。
4．浸透与包埋：
是将组织块制成能进行超薄切片的硬块。
（1）包埋液的组成：
捞片——染色
6．超薄切片染色（正染）
染色的目的：利用重金属盐与组织细胞的不同成份呈不同程
度的结合或吸附，从而造成这些成份对电子散射能力的差异，散射电子多的结构在荧光屏上的图像深暗，称电子密度高;反之即为浅亮，电子密度低，从而起到增强图像反差的作用。
6．超薄切片染色（正染）
重金属盐有铀盐（如醋酸双氧铀）和铅盐（枸椽酸铅）等。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点

透射电镜样品制备流程

在样品制备过程中，应注意保持清洁，避免污染样品。同时，样品制备的过程中需要使用一些有毒的化学试剂，应当注意防护。
样品制备是射电镜观察的关键环节，如果样品不足够细腻或有杂质，就无法得到清晰的观察结果。因此，在制备样品时需要注意以下几点：
样品必须保证足够薄：射电镜的观察效果与样品的薄度成会使用不同的设备和工具。例如，生物样品制备可能需要使用切片机、真空干燥炉等设备；材料样品制备可能需要使用打磨机、拉丝机等设备。
在进行射电镜样品制备时，应根据所要观察的样品的性质和结构选择合适的流程和设备，以便获得清晰的观察结果。
在进行射电镜样品制备时，应注意避免样品污染。样品污染可能会导致观察结果不准确或无法观察。
射电镜样品制备是在进行射电镜观察前必须进行的一项工作，样品制备的流程包括以下几个步骤：
采集样品：样品可以是植物、动物或矿物等，需要使用特殊的工具或方法进行采集。
切割样品：根据所要观察的部位，使用刀具将样品切成较薄的片状。脱水：将切割好的样品浸泡在溶液中，使其脱去水分。透明化：将脱水后的样品浸泡在透明化剂中，使其变得透明。加粘合剂：在样品的表面涂上粘合剂，使其固定在玻片上。贴装：将样品贴装在射电镜的样品台上，准备进行观察。
样品污染的主要原因有：
样品采集过程中的污染：如果样品采集过程中不注意清洁，可能会导致样品污染。
样品制备过程中的污染：如果样品制备过程中使用的设备或工具不清洁，也可能导致样品污染。
周围环境的污染：如果周围环境不清洁，也可能导致样品污染。
为了避免样品污染，应注意保持清洁，使用清洁的设备和工具，并在清洁的环境中进行样品制备。
样品必须透明：样品必须透明，才能够清晰地观察其内部的结构。样品必须稳定：在观察过程中，样品必须保持稳定，否则就无法得到清晰的观察结果。样品必须无杂质：样品必须保证无杂质，否则就会干扰观察效果。

植物透射电镜样品制备技术的改进及不同树脂选择比较

杨瑞，范敬伟，刘文可，王建立，于同泉，房克凤，王绍辉
（农业应用新技术北京市重点实验室，北京农学院植物科学技术学院，北京１０２２０６）
摘
要：针对植物细胞壁组织坚硬，透射电镜样品制备难度大的问题，笔者对样品制备程序化进行探讨；同时，
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＴＥＭ；ｓａｍｐｌｅ；ｒｅｓｉｎ；ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅａｕｔｈｏｒｓｐｒｏｂｅｄｉｎｔｏｐｒｏｃｅｄｕｒａｌｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｉｎｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｕｌｔｒａ — ｍｉｅｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｒｅｓｉｎｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｅｐｏｘｙｒｅｓｉｎ６１８ｉｓｌｅｓｓａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｍｂｅｄｄｉｎｇ．

植物透射电镜样品制备技术的改进

・
４１・
维普资讯
最后，进行逐步、渐进的乙醇或丙酮脱水。分别进行５％０一７％一９％的乙醇脱水，每次１１ｉ。接着用９％乙醇和Ｏ０５ｎｎ０
摘要：应用植物透射电镜样品制备技术的改进方法对双子叶植物、单子叶植物营养器官进行电子显微镜超薄切片制备效果的实验研究，目的是找到一种比常规制备方法更简便、更经济、效果更好的制备技术。实验结果表明：通过对常规制备技术两个方面的改良，以保存较多的微细结构而不被破坏，可清晰度较高，并能保持其原有的形态；制
叶和表面无毛的革质叶进行实验（１；表）取样时间是２００６年４月；取样植物中双子叶植物是：刺毛杜鹃Ｒｏｏｅｄｏｈｄｄｎｒｎｃａｐｏａｏ华丽杜鹃ｍｈｆｌ１ＴｔｅＳｅｔ满山红ｈｍｉｅＨｏｋ，ｎＲ．ａｅ￣ａｔｗｅ，ＴｅＲ．ａｉｉＨｅｓｅＷｉ，ｍｒｓｍ１ｔｌ马银花Ｒ．ｖｌ（ｎ１Ｐａｃ．ｅｉ．ｓｈｏａａ１ｄ．ｌｈ，Ａ）ｎｍｅｘｍ，白珠ＧｕｈｒｕｏａａＢ．ａ．ｒｒ／ａｒｘｉ．Ｍａ滇ａｈｅｉｌｃｃｒ１ｖ１ｃｅｕ／ｚａｅｐ￣（，ｔ）
加蒸馏水１０ｍ，０Ｌ配制成０ｍｌＯ．ｏＬ的磷酸氢二钠溶液为甲２／液；乙液：Ｎ￣Ｐ４Ｈ０２．ｇ加蒸馏水１０ｍ， ② 取ａ０＂２７，Ｈ２６０Ｌ配０
制成０２ｏＬ的磷酸氢二钠溶液为乙液。然后按表２将甲、．ｍｌ／乙两种溶液混合即得到所需要的ｐＨ的缓冲液，本次实验取

透射电镜动、植物、细胞样品取材要求及方法(请正确取材、有效固定)

取材动作要迅速，材料离体后１min内就进入固定液，使组织、细胞尽可能保持原来生活状态，不要超过10min 解剖器械要锋利(如新的手术刀、新的双面刀片)，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤准取材要准确胃肠道、皮肤和角膜、视网膜、耳蜗等要注意方向性（纵切or横切），取材取成条状，确保要观察的部位在切面方向。

组织块的包埋方向与切面方向要十分清楚，尽量自己在包埋前进行定位（定向包埋，竖放or横放）⑶冷取材过程应在低温下（０～４℃）如冰块上操作，以降低酶的活性，减少细胞内结构的损伤。

⑶一般不超过1mm3小肠等取材时要方向性可取成条状；部分可取较大面积但截面约1mmX 1mm（厚度必须小于1mm）固定剂渗透力较弱（戊二醛为0.5mm，饿酸更弱），组织块太大则内部将得不到良好的固定而坏死注:1、2培养细胞的取材贴壁细胞：先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化1500 rpm）10 min积的5～10倍）2.5～3%戊二醛固定液，固定约1h，也可在4悬浮细胞固定：1、离心固定：参考贴壁细胞离心步骤2、琼脂预包埋法：固定液固定的细胞悬液离心，弃上清后在50℃水浴中将细胞团加热，用热的吸管吸一滴已加热融化并冷却至50℃的琼脂，滴入细胞团中，使细胞悬浮。

为避免琼脂凝固，将细胞放入保温的离心管，在3000-5000 rpm离心1min。

在离心管置于水浴条件下，加入70%乙醇，停留1h。

当细胞团被琼脂包埋后，取出切成小块，用常规方法进行双重固定（先戊二醛再饿酸固定）。

植物组织的取材植物组织取材较容易，植物细胞离体后变化不像动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。

因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。

植物材料内部存有的空气会使其漂浮于固定液液面上而影响固定效果，需抽取出气体抽取气体：将植物组织同固定液一起倒入注射器，用戴有乳胶套食指堵住注射器出口，右手拉动针栓；将注射器口垂直向上，松开食指，右手轻推针栓使液面上的气泡从注射器口排出。

透射电镜常规样品制备流程(精)

透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。

尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。

样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。

尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。

②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。

操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。

二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。

广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。

一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。

超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。

但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。

具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。

要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。

③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。

透射电镜制样方法

透射电镜制样方法
透射电镜制样方法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：首先需要选择合适的样品，并进行必要的前处理。

根据需要，可以使用传统的金相方法，如切片、打磨和腐蚀等来制备样品；也可以使用更先进的方法，如离子切片、聚焦离子束等来制备样品。

2. 高真空处理：将样品置于高真空环境下进行处理，以去除气体和水分的影响。

这可以通过在真空槽中加热样品、通入惰性气体等方法来实现。

3. 制备薄片：将制备好的样品制备成足够薄的薄片，通常厚度要求在几十纳米至几百纳米之间。

这可以通过使用超薄切片机或聚焦离子束来实现。

4. 电导涂层：为了提高样品的导电性，可以在样品表面涂上金薄层或碳薄层。

这可以通过蒸镀、溅射、离子镀等方法来实现。

5. 透射电镜成像：将制备好的样品放入透射电镜中，调整仪器参数，如加速电压、透镜聚焦等，进行成像。

可以使用像差校正技术、电子衍射等方法来提高成像质量。

需要注意的是，不同样品的制备方法会有一定差异，制备薄片时要注意避免样品的破裂和变形，电导涂层要均匀且致密，成像时要注意样品与探针的相对位置等
细节问题。

此外，透射电镜制样方法还包括一些先进的技术，如原位制备、低温制备、离子减薄等，可以根据需要选择适合的方法进行制备。

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图3所示的多层结构即为药室内壁的胼胝质加厚现象。可见新方法制备的样品能够提高植物样品的分辨率，使超薄切片显示出更多的微细结构。
3.2 拟南芥
拟南芥是液泡组织较大的植物，在溶液中叶片难以下沉，是较难固定的植物透射电镜样品。加之，细胞壁结构坚硬，药物难以渗透，其样品制备更加困难。若采用常规制备方法，则会出现叶片内部结构不清晰、切片有颤痕和开裂等不良现象，不能进行大视野的结构观察和摄影。笔者采用该方法制备出了30多个此类透射电镜样品，整体信息丰富，结构保存良好，没有出现效果不良现象。
3 结果
3.1杂种鹅掌楸花粉
细胞壁厚，组织坚硬，药物难以渗透，是典型的制备难度大的透射电镜样品。采用常规制备方法，超薄切片常会出现花粉内部结构不清晰、切片有颠痕、污染等不良现象，甚至无法观察到样品的超微结构，造成前功尽弃，只能从头再来，进一步延长了工作周期。笔者采用延长锇酸固定时间，减少树脂渗透浓度的新方法制备出了50 多个杂种鹅掌楸花粉样品，整体信息丰富，结构保存良好，没有出现不良现象。
4 结果
4.1 一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定，时间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，性能区别较大，在后固定时需区别对待，对于迅速发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时，否则，会造成样品发脆，难以操作，甚至破坏掉已保存的结构。
4.2 在812树脂渗透的过程中，采用3：1；3：2； 3：3梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。根据植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢的特点，梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上，否则，影响渗透效果。
研究背景
超薄切片的分辨率高，信息丰富，是透射电镜样品制备方法中最优秀、最常用、最基本的常规技术，从取材到染色有二十几个步骤，任何环节出现问题都会影响到样品制备质量甚至导致样品制备失败。加之，植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢，其制备难度就显得更大一些。
我们经过多次试验，发现采用延长锇酸固定时间和减少树脂渗透浓度的方法可提高植物透射电镜样品的制备成功率和制备质量，使植物的花粉、径、叶、根等细胞结构显示得更加清晰，整体信息提供的更加丰富。经过200多个植物透射电镜样品的观察，不但能准确观察到植物的超微结构形态，还缩短了植物透射电镜样品的制备周期。本课件以杂种鹅掌楸、拟南芥和毛竹三种典型的植物材料为例。
1 材料
1.1 杂种鹅掌楸花粉，南京林业大学校园内随机取样，浸入3%的戊二醛固定。
1.2 拟南芥，南京农业大学提供，采摘后即时浸入3%的戊二醛固定。
1.3 毛竹，江苏大学提供，取样后即时浸入 3%的戊二醛固定。
2 方法
样品在3%的戊二醛中，固定2小时以上，然后0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2次，每次10 分钟，锇酸固定5小时后，0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2次，每次10分钟，丙酮梯度脱水，纯丙酮脱水2次，812树脂按3：1；3：2； 3：3梯度渗透，之后打开样品瓶盖，放置干燥处8小时，再包埋，梯度聚合，切片，染色，透射电子显微镜观察。
图4为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面，可见片面平整、无污染、整体结构保存良好。图5、图6为叶绿体的全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富，结构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。
3.3 毛竹
毛竹根、茎、叶片的细胞壁坚硬密集，药物难以渗透，细胞腔大，样品容易吸收二氧化碳并造成污染，在超薄切片样品制备中属于难度很大的样品。采用常规制备方法时，极易出现切片颠痕、严重多个竹叶样品，取得了较为一致的理想效果。
图7为复水后的毛竹细胞结构状态，片中信息丰富，细胞内含物质和结构都保存良好。
图8和图9为毛竹经过不同工艺处理后的细胞结构比较。图8为经过加热处理后的细胞结构状态，可见细胞形态变化较大，呈扭曲状，但无断裂和损坏现象，内部物质尚能得到保存。切片完整，无颤痕和污染现象。图9为联合处理后的细胞结构状态，图中显示的内部细胞结构变化较小，细胞壁基本处于完好状态，个别细胞壁间出现断裂现象，细胞内部物质保存良好，可见此工艺对毛竹的整体损伤较小。
4.3 样品经树脂梯度渗透后，必须在干燥处放置 8小时以上，最好过夜，否则，在切片时会出现发散现象。
4.4 812树脂的渗透性能和切割性能都比较好，是制备植物样品的良好材料，但容易受潮，一旦受潮发软，切片上会出现波浪型条纹，轻则影响观察效果，重则无法看到细胞结构。因此，配制812树脂、树脂渗透和包埋等环节都要在干燥的环境中进行。尤其在样品渗透时必须放置在干燥器内或其他干燥、干净的环境中过夜，使丙酮彻底挥发掉。否则，会造成超薄切片制备失败。
植物透射电镜样品制备技术探讨
徐柏森杨静南京林业大学电镜室
研究背景
近年来，随着林业经济的不断发展，研究植物资源的内容也越来越深入，利用透射电镜掌握大量的植物细胞信息，已经成为科学工作者保护森林资源和人类生态环境的重要理论依据。但因植物材料坚硬，难以制备出高分辨的透射电镜样品，从而限制了透射电镜在植物研究中的应用，同时也影响了人类对植物资源的开发和利用。为此，电镜样品的制备技术一直是电镜工作者深入研究的重要内容。
图1为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌，可见花粉内部细胞器结构保存良好，细胞壁结构保存完整，边缘信息丰富，在许多花粉中都可见到尾状突起。
图2为败育的杂种鹅掌楸花粉全貌，可见花粉内部的质体减少，线粒体变异，细胞器呈退化状态，边缘的细胞壁组织也出现了明显的变异和加厚现象，使药物更难渗透，对于此类样品若采用常规方法制备，则结构模糊，信息量较少，往往只能看到少量的片层结构。采用改进方法对其进行制备时，由于固定彻底、渗透均匀，不但可以很好的保存组织结构，还可以提供丰富的信息资料。