透射电镜标本制备方法
透射电镜生物样本制备流程及注意事项
透射电镜生物样本制备流程及注意事项透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种使用电子束而不是光束进行成像的显微镜。
它可以提供高分辨率的图像，因此被广泛应用于生物样本的观察和研究。
然而，由于其特殊的工作原理和生物样本的复杂性，透射电镜生物样本的制备过程需要注意一些关键的步骤和细节。
下面将逐步介绍透射电镜生物样本制备流程及注意事项。
一、样品固定1.选择合适的固定剂：固定剂的选择应根据所研究的样本类型和要观察的细胞结构而定。
常用的固定剂包括戊二醛（glutaraldehyde）、乙酰化亚胺（acrolein）、纤维蛋白素（formaldehyde）等。
2.采取合适的固定时间和固定温度：固定时间和温度应根据固定剂的要求和样本的特性进行优化。
通常情况下，固定时间为数小时至数天，温度在4℃至25℃之间。
3.注意透射电镜样品的固定深度：样品应保持较小的厚度以便透射电子束的穿透。
二、样品剖解1.剖解细胞膜：通常采用超声波振荡或冷冻断裂等方法来剖解细胞膜。
超声波振荡可用于含有细胞膜的细胞或组织，而冷冻断裂则适用于脆弱细胞和膜脂体系。
2.剖解细胞核：利用离心裂解法可以将细胞核分离出来。
离心裂解可分为机械法和渗透法两种，机械法利用高速离心的作用将细胞核分离，而渗透法则是通过渗透剂将细胞核溶胀并破碎。
三、样品固化1.脱水：样品在固定后需要进行脱水处理，以便在后续的步骤中更好地渗透和浸透。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮和乙醚等，脱水过程往往需要进行多次重复。
2.浸透：在脱水后，样品需要在树脂中进行浸透，使其固化为坚硬的样品。
通常采用环氧树脂或比较稳定的丙烯酸树脂来进行浸透。
这一步骤通常需要较长时间，如数小时甚至数天。
3.树脂填充：浸透后的样品需要在模具中进行树脂填充，并在适当的温度下进行固化。
树脂填充的过程需要注意排除气泡和避免过度填充。
四、样品切片1.选择合适的切割工具和方法：样品通常使用切片机和切片刀进行切割。
细菌透射电镜样品制备方法
细菌透射电镜样品制备方法
细菌透射电镜样品制备可参考以下步骤：
1. 将适量无菌水加入生长良好的细菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。
2. 用无菌滤纸过滤菌悬液，并调整滤液中的细胞浓度为10^8-10^9个/毫升。
3. 取等量的上述菌悬液与等量的2％的磷钨酸钠水溶液混合，制成混合菌悬液。
4. 用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
5. 经3-5分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，置低倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网。
细菌透射电镜样品制备的方法还有很多，具体步骤可能因细菌的种类和实验需求而有所不同。
透射电镜样本的制备
喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的
喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。 喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。 但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗 费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故 此法不常用。
漂浮法 ：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴 上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的 液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜 网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。
负染
阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首 先由hall在1955年提出。 Hall在病毒研究中用磷钨酸 染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的 "空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染 色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现 黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正 染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高 的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结 果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。 两者之间的反差正好相反，故称为负染色
H2O
90% 丙酮
15min
100% 丙酮
20min 20min
浸透和包埋
通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂， 使其渗透到组织细胞中去
以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的 固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的 作用，有利于超薄切片。
丙酮：包埋剂 2：1 丙酮：包埋剂 1：1 纯包埋剂 包埋
5mL 10mL 20mL 30mL 40mL 50mL
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
透射电镜样品制备步骤
透射电镜样品制备步骤透射电镜是一种重要的材料表征技术，它利用电子的波动性和微粒性来观察材料的结构和性质。
为了能够使用透射电镜观察样品，首先需要对样品进行制备。
透射电镜样品制备步骤如下：1.选择合适的样品：透射电镜样品可以是固体、液体、薄膜或纳米颗粒等。
根据研究目的和样品性质选择合适的样品。
2.样品预处理：根据样品性质的不同，进行必要的预处理。
例如，对于固体样品，可以选择切割、抛光或电解抛光等方法来得到平滑的表面。
3.样品固定：将样品固定到透射电镜样品架上。
不同的样品有不同的固定方法。
例如，对于固体样品，可以使用导电胶将其固定在样品架上。
4.薄层制备：对于厚度过大的样品，需要将其制备成透明的薄层以便透射电镜观察。
常用的方法有机械研磨、电子束刻蚀或离子束刻蚀等。
5.样品清洁：将样品放入超声波清洗机中进行清洗，以去除可能附着在样品表面的杂质或污染物。
6.特殊处理：如果需要对样品进行特殊处理，例如加热、冷冻处理或受到特定环境气氛的影响等，根据需要进行相应的处理。
7.样品干燥：将样品放入真空或氮气环境中，以确保样品干燥。
避免样品受到水汽的污染。
8.获得薄片：使用切片机将固态样品切割成适当厚度的薄片。
为了获得高质量的薄片，可以选择特殊的切片工具和技术，例如离子束切片或低速钻磨切片。
9.薄片形状整理：使用不同的研磨和抛光方法，将薄片的形状和表面进行调整，以确保样品的平滑度和一致性。
10.网格制备：将薄片粘贴在透射电镜网格上。
网格可以增强样品的稳定性和保护，同时提供用于定位和标识的标记。
11.后续处理：根据研究目的和透射电镜分析的要求，可以对样品进行进一步处理。
例如，可以进行染色、脱膜、溅射或腐蚀等处理。
以上是透射电镜样品制备的一般步骤。
不同样品和研究目的可能会有所不同。
因此，根据具体的研究需求和样品特点，制备过程可以做相应的调整和优化。
透射电镜生物样品制备步骤
透射电镜生物样品制备步骤
一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：
2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
1%锇酸固定液固定2-3小时
用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次
三．脱水：
50%乙醇15-20分
70%乙醇15-20分
90%乙醇15-20分
90%乙醇90%丙酮（1：1）15-20分
90%丙酮15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮室温15-20分三次
四．包埋：
纯丙酮+包埋液（2：1）室温3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温过夜
纯包埋液37度2-3小时
五．固化：
37度烘箱内过夜
45度烘箱内12小时
60度烘箱内48小时
六．超薄切片机切片70 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜JEOL JEM-1230（80KV）观察。
拍片。
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：首先需要选择合适的样品，并进行必要的前处理。
根据需要，可以使用传统的金相方法，如切片、打磨和腐蚀等来制备样品；也可以使用更先进的方法，如离子切片、聚焦离子束等来制备样品。
2. 高真空处理：将样品置于高真空环境下进行处理，以去除气体和水分的影响。
这可以通过在真空槽中加热样品、通入惰性气体等方法来实现。
3. 制备薄片：将制备好的样品制备成足够薄的薄片，通常厚度要求在几十纳米至几百纳米之间。
这可以通过使用超薄切片机或聚焦离子束来实现。
4. 电导涂层：为了提高样品的导电性，可以在样品表面涂上金薄层或碳薄层。
这可以通过蒸镀、溅射、离子镀等方法来实现。
5. 透射电镜成像：将制备好的样品放入透射电镜中，调整仪器参数，如加速电压、透镜聚焦等，进行成像。
可以使用像差校正技术、电子衍射等方法来提高成像质量。
需要注意的是，不同样品的制备方法会有一定差异，制备薄片时要注意避免样品的破裂和变形，电导涂层要均匀且致密，成像时要注意样品与探针的相对位置等
细节问题。
此外，透射电镜制样方法还包括一些先进的技术，如原位制备、低温制备、离子减薄等，可以根据需要选择适合的方法进行制备。
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法
透射电镜制样是实验室中极为重要的一项技术操作，它将不同结构和尺寸的样品细粒度地进行分离，使之适应望远镜进行观察。
目前实验室高等学校科研都广泛运用透射电镜进行材料研究。
透射电镜制样大致可分为以下步骤：
1.准备样品：将细分的材料（如金属、碳、化学物质等）放在石英板上，以保证材料表面光滑。
2.制备标本：用刮子将样品按一定密度均匀地刮到石英板上制备出一个标本，再在标本表面进行抛光，使标本表面光滑，并保证其大小和厚度圆滑兼容。
3.金相分析：将抛光的标本放在金相检测仪上，通过金相范式素材库，自动检测标本的组成成分，较快准确得出有关分析结果。
4.涂覆镜片：将样品夹在两个玻璃挡板间，倒入特殊的样品涂覆液，将两片玻璃挡板缓慢压缩，使涂覆液平稳均匀地涂覆到样品表面，以形成镜片。
5.放入电镜：将涂覆后的样品放入透射电镜，并用调节电源选择对应的廓线调节器，即可通过连续的廓线选择实现不同的形状的样品的聚焦。
6.观察分析：在放大可视屏上观察样品，然后拍照或录制，以便进一步分析。
以上就是透射电镜制样的大致步骤，制备一个完美样品需要仔细操作，技术人员必须熟悉此项技术操作，并结合实际材料和实验步骤多次实践，以达到良好的实验效果。
透射电镜样品制备方法及优缺点
透射电镜样品制备方法及优缺点
透射电镜样品制备主要分为两步，即液体/固体样品处理和超薄切片制备。
1、液体/固体样品处理
第一种方法是基于普通电镜样品制备的双步处理法，即第一步用电子束处理样品表面，使其导电，再经过透射电子束进行处理。
在这种方法下，样品表面层只有几百到几千纳米厚，因此，只有比较薄的样品才能够得到满意的结果。
另一种方法是采用高真空下的固态电子涂覆，即将样品表面涂覆上薄层特殊金属。
例
如可以用铱、金、铂或其它金属的熔合物作为涂层，以获得特殊的涂层电导能力，从而保
证样品的电子图像分辨率和可视深度。
2、超薄切片制备
超薄切片制备分为超声切片和非超声切片两类。
超声切片通常是采用高能量超声波振
荡使容易被劈开的液体/固体样品形成自发非规则薄片，有时还可以加入一定量的碎薄片，从而使超声对样品的透射变的更容易，提高了结果的准确性。
非超声切片制备则采用比较稳定的技术来实现，如钻石刀片切割、钝型刀制备和原子
力显微镜焦点束来制备，具有薄层切片准确厚度的特点，且可以满足多层次数据获取。
优点：
1、透射电镜样品制备要求低，可以在常规实验室条件下完成，便于实验和分析；
2、采用精确远离样品表面的电子束，使放大比例高，且能够获得更高的分辨率和更
深的可视深度；
3、三维结构复杂的物质可以藉由采用不同的金属包覆来进行分析；
1、制备过程繁琐复杂，容易出现样品分析结果不精确的情况；
2、物质表面多层次结构信息分析难度大，可能会影响分析结果准确性；
3、结构深度较大时，获取信息较困难，分析效果受到影响。
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透射电镜样品制备方法
透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求
组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。
因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。
也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将
不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
推荐使用手术刀或双面刀片。
（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。
二．取材方法（按照自己的样品类型检索）
1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）
动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。
用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。
用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的
1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。
*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。
送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。
送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。
后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。
2.体外培养细胞的取材（在冰浴上进行）
培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出培养液，用磷酸盐缓冲液清洗培养皿后使用胰酶消化（注意消化程度不可太过），轻轻收集细胞，将悬液转移到离心管中，离心机4℃低速离心（2000转/分）10分钟，使细胞聚成团块，弃去上清，沿壁小心加入新鲜的固定液。
保持细胞成团状态，于4℃冰箱中固定，如细胞团体积大于15 ul，固定30 min后用注射器针头将细胞团挑离管壁，可将大团细胞划开成小团，因为团块太大会影响
内部固定效果，但是不可挑成弥散状。
原则是必须保证有数个不小于芝麻大小的固体团块，才可以后续操作。
冰箱内固定2-3小时。
*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。
送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。
送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。
后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。
3.植物组织取材
植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物细胞那么迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透，因此，植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状，推荐使用配方为：（多聚甲醛4%和戊二醛2.5%）的固定液，固定过夜。
*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。
送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。
送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。
后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。
4.细菌及藻类等样品取材
对于不易成团的样品，需先清洗，加入固定液后吹散，于4℃冰箱中固定2-3小时或者过夜，固定结束后，磷酸盐缓冲
液清洗3次，继续按照文献《琼脂铸模法制备透射电镜样品》（白焕红）内描述方法进行琼脂预固定。
再将琼脂预包埋后的
样品于4℃冰箱中固定过夜。
*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。
送样前请用磷酸盐缓冲液于4度
冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。
送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。
后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用
透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。
磷酸盐缓冲液（三个步骤）
1.磷酸盐缓冲液（0.2M）
甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液
Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g
加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml
2. 按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液（pH值一般为7.4）
0.2M磷酸盐缓冲液的配制
2.将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。
改良版琼脂铸膜法：
1．参照之前方法收取藻或细菌，固定清洗后制成高浓度样品悬液备用（一般10 ul固体加入10 ul磷酸盐缓冲液）
2．1.5 ml的EP管，剪下管盖，用剪刀或者烧热的镊子在正中间钻一个圆形小孔，将20ul的枪头插在小孔内，再盖回EP管时，可见枪头在EP管内部悬空，不碰到管壁。
3．向EP管内注入1ml浓度1.5%—2%的热琼脂，盖上第2步做好的管盖，以枪头没入液面下0.5cm为准——如果灌的琼脂少于1ml或者枪头没入太深，会造成后面的操作困难。
完成后放在四度或者室温等待充分凝固。
4．凝固后先小心拔出枪头，可见形成一个小孔，即可开盖使用。
5．用黄枪头把第一步做好的悬液加入小孔内，5000转离心5分钟左右，取出后可见样品沉积在小孔底部，一般有2-3mm深，上方的上清液用剪细的滤纸条吸干，但是尽量不要把纸条插进样品里。
注意，未吸干会造成下一步封口不严。
6．吸干后，用黄枪头吸取100ul热琼脂灌注封口，一次性注入，溢出也没关系，等待冷却。
这个步骤尽量避免在小孔内产生气泡，需要多练习。
7．全部聚合后，取出琼脂块，修切成截面为1.5mm*1.5mm的立方柱。
8．每组样品做2-3个包埋块，做好后4度冰箱内戊二醛固定过夜。
9．按照常规样品进行保存和清洗。