透射电镜制样步骤以及注意事项
透射电镜生物样本制备流程及注意事项
透射电镜生物样本制备流程及注意事项透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种使用电子束而不是光束进行成像的显微镜。
它可以提供高分辨率的图像，因此被广泛应用于生物样本的观察和研究。
然而，由于其特殊的工作原理和生物样本的复杂性，透射电镜生物样本的制备过程需要注意一些关键的步骤和细节。
下面将逐步介绍透射电镜生物样本制备流程及注意事项。
一、样品固定1.选择合适的固定剂：固定剂的选择应根据所研究的样本类型和要观察的细胞结构而定。
常用的固定剂包括戊二醛（glutaraldehyde）、乙酰化亚胺（acrolein）、纤维蛋白素（formaldehyde）等。
2.采取合适的固定时间和固定温度：固定时间和温度应根据固定剂的要求和样本的特性进行优化。
通常情况下，固定时间为数小时至数天，温度在4℃至25℃之间。
3.注意透射电镜样品的固定深度：样品应保持较小的厚度以便透射电子束的穿透。
二、样品剖解1.剖解细胞膜：通常采用超声波振荡或冷冻断裂等方法来剖解细胞膜。
超声波振荡可用于含有细胞膜的细胞或组织，而冷冻断裂则适用于脆弱细胞和膜脂体系。
2.剖解细胞核：利用离心裂解法可以将细胞核分离出来。
离心裂解可分为机械法和渗透法两种，机械法利用高速离心的作用将细胞核分离，而渗透法则是通过渗透剂将细胞核溶胀并破碎。
三、样品固化1.脱水：样品在固定后需要进行脱水处理，以便在后续的步骤中更好地渗透和浸透。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮和乙醚等，脱水过程往往需要进行多次重复。
2.浸透：在脱水后，样品需要在树脂中进行浸透，使其固化为坚硬的样品。
通常采用环氧树脂或比较稳定的丙烯酸树脂来进行浸透。
这一步骤通常需要较长时间，如数小时甚至数天。
3.树脂填充：浸透后的样品需要在模具中进行树脂填充，并在适当的温度下进行固化。
树脂填充的过程需要注意排除气泡和避免过度填充。
四、样品切片1.选择合适的切割工具和方法：样品通常使用切片机和切片刀进行切割。
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。
常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。
超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。
此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。
也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
（4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
二．取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。
如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。
1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法
首先，样品的准备是透射电镜制备的第一步。
在进行透射电镜
样品制备之前，需要选择合适的样品。
样品可以是固体材料、生物
组织、纳米材料等，根据研究的目的和对象进行选择。
在选择样品
的过程中，需要考虑样品的形态、尺寸、结构等因素，以确保样品
能够满足透射电镜观察和分析的要求。
其次，样品的制备过程需要严格控制。
对于固体材料样品，通
常需要将样品切割成薄片或薄膜，以确保透射电镜的电子束能够穿
透样品并产生清晰的像像。
对于生物组织样品，通常需要进行化学
固定、脱水、包埋等处理，以保持样品的形态和结构。
对于纳米材
料样品，通常需要将样品分散在适当的溶剂中，并在透射电镜网格
上制备成薄膜。
在样品制备的过程中，需要注意避免样品的污染和
损坏，确保样品的原貌和结构不受影响。
最后，在透射电镜样品制备完成后，需要进行适当的检测和验证。
可以通过光学显微镜、扫描电子显微镜等手段对样品进行初步
的观察和分析，以确保样品的质量和完整性。
在透射电镜观察之前，还需要对样品进行真空干燥等处理，以避免在透射电镜中产生气泡
和水膜等影响观察效果的问题。
总之，透射电镜样品制备是透射电镜观察和分析的基础，正确的样品制备方法对于获得准确、可靠的实验结果至关重要。
在进行透射电镜样品制备时，需要选择合适的样品、严格控制制备过程，并进行适当的检测和验证，以确保样品的质量和完整性。
希望本文提供的透射电镜样品制备方法能够对相关研究工作有所帮助。
透射电镜的样品制备方法详解
透射电镜的样品制备透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）．透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备．（１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可．（２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤：ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直接切割．ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来．ｃ预减薄使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至１０μｍ厚．用研磨机磨（或使用砂纸），可磨至几十μｍ．ｄ终减薄对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害．对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的．离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快．离子减薄会产生热，使样品温度升至１００～３００度，故最好用液氮冷却样品．样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤．离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄（把他们用树脂拌合后，装入φ３ｍｍ金属管，切片后，再离子减薄）．也可以聚集离子术（ＦＩＢ）对指定区域做离子减薄，但ＦＩＢ很贵．对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于１００ｎｍ的薄膜．这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变．（３）金属试样的表面复型即把准备观察的试样的表面形貌（表面显微组织浮凸）用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜（叫做复型）进行透射电镜观察与分析．复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等．制备复型的材料本身必须是＂无结构＂的，即要求复型材料在高倍成像时也不显示其本身的任何结构细节，这样就不致干扰被复制表面的形貌观察和分析．常用的复型材料有塑料，真空蒸发沉积炭膜（均为非晶态物质）．常用的复型有：ａ塑料一级复型，分辨率为１０～２０ｎｍ；ｂ炭一级复型，分辨率２ｎｍ，ｃ塑料－炭二级复型，分辨率１０～２０ｎｍ；ｄ萃取复型，可以把要分析的粒子从基体中提取出来，这种分析时不会受到基体的干扰．除萃取复型外，其余复型只不过是试样表面的一个复制品，只能提供有关表面形貌的信息，而不能提供内部组成相，晶体结构，微区化学成分等本质信息，因而用复型做电子显微分析有很大的局限性，目前，除萃取复型外，其他复型用的很少．。
透射电镜细胞样品制备流程
透射电镜细胞样品制备流程以透射电镜细胞样品制备流程为标题，我们来介绍一下这个过程。
透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种高分辨率的显微镜，可以用来观察非常微小的细胞结构和内部细节。
为了获得高质量的透射电镜图像，样品的制备非常重要。
下面我们将详细介绍透射电镜细胞样品制备的流程。
第一步，收集细胞样品。
可以选择不同类型的细胞样品，如动物细胞、植物细胞或微生物细胞。
细胞样品可以从生物实验室中获得，也可以通过培养细胞来获取。
第二步，固定细胞样品。
固定是为了保持细胞在制备和观察过程中的形态和结构。
常用的固定剂有乙醛、戊二醛等。
将细胞样品与固定剂混合，使细胞膜和细胞器固定在原位，停止细胞内部的生化反应。
第三步，脱水样品。
将固定的细胞样品通过一系列浓度递增的乙醇溶液进行脱水处理。
脱水的目的是去除细胞内外的水分，使样品适合后续的浸渍和包埋。
第四步，浸渍和包埋样品。
将脱水后的细胞样品置于透明的有机溶剂中，如丙酮或环氧树脂。
浸渍的目的是使样品与嵌入剂之间充分接触，逐渐将有机溶剂替换为嵌入剂。
然后将样品转移到嵌入剂中，使细胞样品被完全包裹在固体嵌入剂中。
第五步，切片样品。
使用超薄切片机将包埋的细胞样品切成非常薄的切片，一般为50-100纳米。
切片的过程需要非常小心和精确，以确保切片的质量和一致性。
第六步，上膜样品。
将切好的细胞样品转移到透明的膜上，如碳膜或铜膜。
上膜的目的是增强样品的稳定性和导电性，以便在透射电镜中观察。
第七步，染色样品。
可以使用染色剂来增加样品的对比度和可见度。
常用的染色剂有重金属盐（如铋盐）和阴离子染料（如尼格罗红）。
染色的过程需要小心操作，以避免染料的过度使用或样品的损坏。
第八步，干燥样品。
将上膜和染色后的样品放置在通风设备中，使其自然干燥。
干燥后的样品可以储存在干燥剂中，以保持其稳定性和保存时间。
将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
通过透射电镜，我们可以获得高分辨率和高对比度的细胞图像，从而更好地研究细胞的结构和功能。
透射电镜制样流程
透射电镜样品制备过程
组织取材（60s内），体积<1mm3，之后进行如下步骤
1）前固定：3%戊二醛2h或过夜。
2）漂洗：磷酸缓冲液，3次，10min/次。
3）后固定：1%锇酸固定液，2h。
4）漂洗：（同上）。
5）梯度脱水：50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮两次，各10min 。
100%丙酮两次，各15min。
6）渗透：丙酮/包埋剂（1:1,1:2），室温各1h。
丙酮/包埋剂1:3, 4度过夜。
纯包埋剂，4度过夜。
7）包埋：纯包埋剂（37度,45度,60度各24h）。
取出包埋块，进行超薄切片，片厚70nm。
分别采用醋酸双氧铀对切片进行染色30min，双蒸水漂洗3-5次，之后用柠檬酸铅
染色10min，双蒸水漂洗3-5次。
待切片干燥后，透射电镜观
察。
切片机型号：Leica UC7 超薄切片机，速度1mm/s.
透射电镜型号：日立高新HT7700，电压80kv 电流10μa.。
透射电镜样品制作
透射电镜样品制作 Last revised by LE LE in 2021透射电镜样品包埋块制作原理步骤一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入4℃戊二醇固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态。
2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织。
3、组织块大小：取材医生可先切成长条形，然后再修成约1mm3大小。
二、固定：固定目的是把细胞在活体状态时的超微结构细节尽可能完整地保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。
同时也使细胞内的各种成分固定下来，避免以后的冲洗和脱水时溶解和流失。
理想的固定剂应具备以下特点：能够迅速又均匀地渗透到组织结构内；能够稳定细胞各种结构成分，使之在以后处理过程中不致溶解和丢失；对细胞超微结构没有损伤；能供细胞化学测定并能增强图像反差。
当然，满足所有要求的固定剂是不存在的，目前常用固定剂有锇酸和戊二醇。
1.使用锇酸的注意事项：锇酸即四氧化锇，它能和细胞内绝大多部分成分反应，且能够保护脂肪，但对碳水化合物、糖类和核酸保护作用差，锇酸渗透差，分子密度大，经锇酸固定的组织在电镜下能获得较好反差。
锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，对呼吸道有强烈刺激作用，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
常用的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用稀释成1%的锇酸溶液。
2.戊二醇戊二醇能够稳定糖原，同时保存某些锇酸保护作用差的蛋白质结构，对酶活性破坏小。
对微管、滑面内质网等固定较好，对脂肪保护差，且反差小，因此必须和锇酸配合使用，即“双重固定法”。
3.固定方法：样本先用%戊二醇在4℃下固定2h，经PBS缓冲液多次清洗后再用1%锇酸固定2h。
根据不同组织，可适当延长固定时间。
由于戊二醇能够和锇酸反应产生电子致密的还原锇沉淀，组织经戊二醇固定后，必须将戊二醇清洗干净才能转入锇酸。
此外，锇酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此锇酸固定后也应用PBS清洗液进行清洗干净方能进行脱水处理。
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透射电镜制样步骤以及注意事项
透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）
是目前最常用的高分辨率电子显微镜，可以用于观察物质的微观结构。
制
备TEM样品的过程非常重要，下面将详细介绍TEM制样的步骤以及需要注
意的事项。
制备TEM样品的步骤一般包括样品的选择、固定与固化、切片、薄化、网格制备和贴膜等。
第一步是样品的选择，样品应具有研究价值且适合观察。
例如，生物
样品可以是细胞、组织或器官的薄片，金属样品可以是扁平的块状、粉末
或薄膜等。
第二步是固定与固化。
对于生物样品，常用的固定方法包括浸泡法、
灌注法和切片冷冻法；对于无机样品，可以使用固定剂将样品固定在固定
剂中。
第三步是切片。
将固定好的样品切割成薄片，一般要求薄片的厚度在100 nm以下，通常使用超薄切片机来进行切割。
第四步是薄化。
将切割好的样品进行薄化处理，使其达到TEM观察所
需的薄度。
常见的薄化方法有机械薄化、电化学薄化和离子薄化等。
第五步是网格制备。
将薄化好的样品放置在铜网格上，网格的选取应
该根据所研究样品的性质和需要进行选择。
最后一步是贴膜。
将组织切片或带有样品的网格进行贴膜，以保护样
品并提高图像的对比度。
在以上步骤中，需要注意的事项有：
1.样品在制备过程中要避免受到污染或氧化，尽量在纯净无尘的环境中进行操作。
2.固定剂的选择要合理，不同的样品可能需要使用不同的固定剂，应根据需要进行选择。
3.切片时要注意刀片的尖锐度和切割角度，以免对样品造成损伤或变形。
4.薄化过程中要控制好加工参数，以保证样品的均匀薄化。
5.制作网格时应选择合适的网格尺寸和类型，以适应观察需求。
6.贴膜时要使薄膜均匀平整，并避免出现气泡或杂质。
总之，TEM制样是一项复杂而关键的过程，要保证样品的质量和可观察性，需要仔细选择方法、控制操作参数、注意样品的保护与处理。
合理的样品制备能够获得高质量的TEM图像，并提供准确的实验数据和结论。