植物基因工程总结

第一章概述

植物基因工程的研究范围；相关学科；历史和现状；理论和现实意义；研究步骤。

第二章转化系统

根癌农杆菌Ti质粒转化系统；植物病毒载体系统；植物原生质体转化

系统；植物组织及整体水平的转化系统；转化供体DNA的基本特点；转化系统的选择；转化选择标记基因；转化体的鉴定。

第三章目的基因的获得和植物基因启动子的分离

目的基因的分离克隆；功能蛋白组技术分离目的基因；基因文库技

术分离目的基因；mRNA差别显示技术分离差别表达基因；图位克隆目的基因；标签法分离克隆目的基因；酵母双杂交系统分离目的基因；基因芯片技术及生物信息学技术在分离克隆目的基因中的应用。植物基因启动子的分离克隆。

第四章外源基因在转基因植物细胞内的表达调控

转录调控序列对外源基因表达的影响；mRNA 3'-端非编码序列对外源基因表达的影响；5'-端内含子的影响；外源基因在转译水平表达的调控；外源基因转译后的细胞内定位及加工；外源基因的整合、重排及甲基化；外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响；转基因沉默的类型及其机理；克服转基因沉默的策略。反义RNA, RNAi, Knock out技术。

第五章植物基因工程动态

抗病植物基因工程；抗虫植物基因工程；抗除草剂植物基因工程；抗逆植物基因工程；品质改良；花形花色控制；雄性不育系的创建；生物反应器。

绪论

植物基因工程定义(朱桢）：采用工程设计的方式，通过体外DNA重组技术，将特定的外源基因导入受体植物细胞内，由此获得的转化植物可以表现出预期的遗传特性，具有上述特点的科学被称之为植物基因工程。

转化：外源DNA通过载体﹑媒体或其他物理﹑化学方法导入植物细胞并得到整合及表达的过程。实现这一过程的途径称之为“转化系统”转化系统包括载体系统和受体系统。受体系统的要求：易再生，再生频率高，稳定性、重复性好。

直接把野生型Ti质粒作为载体存在的问题：

a. Ti质粒大，不易直接操作。

b.酶切位点太多。

c.T-DNA区内有许多不需要的编码基因。

d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，得到重组质粒，只能在农杆菌中扩增，而农杆菌的接合转化率很低。

e. Ti质粒上有一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。

Ti质粒的改造：

1、除去T-DNA上的生长素（tms）和细胞分裂素（tmr）生物合成基因，

因为大量的生长素和细胞分裂素会抑制细胞再生为整株植物；

2、除去T-DNA上的冠嘤碱合成基因（tmt）；因为冠嘤碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；

3、除去TTii 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；

4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；

5、安装植物细胞的筛选标记，如neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；

6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。

先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为“中间载体（intermediate vector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲载体（disarmed vector）。

一元系统中间载体的特征：

①中间载体必须含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；

②它应具有一个或几个细菌选择标记，便于筛选共整合质粒；

③它必须有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；

④它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；

⑤它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；

⑥无Ti质粒的边界序列。

双元载体（binary vecter）系统是指由两个分别含TDNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）.

一元载体与二元载体系统的比较：

植物基因转化载体必须具备的两个功能。

（1）媒介，整合

（2）提供被寄主细胞复制，转录系统识别的DNA序列

RNA病毒作为基因载体的基本方法

①单链病毒RNA反转录成一条单链cDNA（ssDNA）②合成双链cDNA（ds cDNA）③双链cDNA在细菌质粒或Cosmide中克隆④外源基因插入到克隆质粒的cDNA中⑤把带有外源基因的cDNA转录成RNA再感染植物

病毒载体系统的评价

优点：①感染方式简单（CaMV，TMV）

②可以产生系统感染③外源基因拷贝数大，有利于表达，产率高

缺点：①外源基因不能遗传给子代植物（TGMV除外）

②病毒基因组小，运载基因能力有限③宿主限制大④感染条件限制

转化频率

相对转化频率：获得的转化克隆数/存活克隆数×100％

绝对转化频率：获得的转化克隆数/使用的细胞数×100％

植板率：总存活数/使用的细胞数×100％

基因枪法方法的优劣评价

优点：1.方法简单，不用分离原生质体

2.适应范围广，无种属特异性

3.观察结果快，直观

4.可进行组织特异表达及基因表达调控研究、发育相关基因及功能

5.再生植株容易

6.可用于细胞器转化

7.可进行大片段DNA转化、多基因转化

缺点：1.嵌合体比率大，遗传稳定性差、遗传分析困难

2. 多拷贝插入

3. 花费大

种质系统介导基因转化：所谓种质转化系统是指借助生物自身的种质细胞为媒体，来实现外源DNA转化的目的。其特点是：

1、转化的DNA可以是裸露的或重组在质粒DNA上 2.转化不依赖物理化学过程 3.不需要离体培养过程4.方法简单易行，与常规方法结合。报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

报告基因，必须具备几个条件：

（1）已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。

转化体的鉴定程序：

1.抗性选择

2.标记基因的活性检测

3.Southern Blot

4.插入拷贝数的确定（图）

5.转录证据（Norethern Blot）

6.外源基因转译产物的鉴定

(1) Western Blot

(2) 酶联免疫法测定

(3) 生物活性测定

7.染色体检验 8.子代的遗传稳定性分析（图）9.PCR辅助分析

动物基因在植物细胞中不表达的原因

a.启动子不能被植物细胞识别，不能起始转录（hsp70 例外）

b.内含子序列不同，hnRNA 的加工修饰受阻。（虽然内含子边界相同GT/AG ，但长度和AT含量不同，植物较短100-200bp ,而且AT含量高，因此植物细胞不能切除动物内含子）

c.动物细胞Poly A信号与植物不同，因此不能有效地识别

d.动、植物的翻译系统的起始序列不同。动物是CACCAUG

植物是AACAAUGGC

所以，当用动物基因转化植物时要考虑这些差异，构建载体

质粒时应采用植物的调控序列.

增强子的作用是增强RNA的转录效率，其功能是通过结合特定的转录因子或影响DNA的构象而实现的。

增强子作用的三个特点：

1.它与启动子的相对位置和取向无关，具有远程效应

2.需要特定的蛋白质因子的参与

3.有些（如SV40的增强子)能在几乎所有类型细胞中发挥作用，而大多数具有相对的组织特异性

目前已分离的大量的启动子（包括增强子）按其作用方式大体可划分为三类 1、组成型 2、诱导型 3、组织特异型

转基因植物中外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响

位置效应：Hilder认为，位置效应是由于插入位点附近染色体的微环境影响了外源基因启动子的表达所致。

等容线（isochore):在染色体的各个区段，碱基组成是不均匀的，在某些区段常含有固定的较高的GC碱基对，这样的组成方式，称为等容线。

重组（重排）效应：转基因很容易被植物基因组的重组和修复系统所识别，结果将使外源DNA不同程度的重排。转基因的同源和非同源的重组必然引起DNA的易位、缺失、重复等结构变化。

甲基化作用（Methylation)高等植物DNA中大约30％的胞嘧啶核苷酸残基被甲基化，抑制基因的表达。是由于甲基化酶作用，真核细胞中

多发生在CG二核苷酸对。对基因表达的作用：1.影响DNA与蛋白质的相互识别2.影响DNA的构像。Z－DNA

转基因沉默：转基因在受体植物中往往不能稳定表达，有时甚至完全不表达，出现了所谓的转基因沉默现象（transgene silencing）是指利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因在当代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。

转基因沉默的机理：

外源基因进入受体细胞核后，会受到多种因素的作用，根据其作用机制和水平不同可分为三种：位置效应（position effect）、转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）和转录后水平的基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。涉及DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA 分子之间的相互作用。

RNAi：RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

RNAi的反应过程：

1.双链RNA进入细胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA；

2.在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA；

3.SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，同与siRNA 互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶降解，另一方面以SiRNA作为

引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。

4.结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。

从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

抑制性差减杂交(SSH)原理：

SSH是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR 则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。

基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位基因组中基因的结构和组织形式，以及目的基因的分离等。

cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能，以及目的基因的分离等。

构建文库的程序：

1.DNA的制备及片段化，或cDNA合成

2.载体的选择及制备

3.DNA or cDNA与载体连接

4.重组体转化宿主细胞

5.转化细胞的筛选

构建文库的载体

1.质粒

2.噬菌体

3.cos 质粒（cosmid）

4.人工染色体

YAC (yeast artificial chromosomes)酵母人工染色体

BAC (bacterial artificial chromosomes细菌人工染色体TAC(可转化人工染色体）

PAC（植物人工染色体）

图位克隆的基本程序：

1.建立目的基因的遗传分离群体

2.找到与目标基因紧密连锁的分子标记

3.用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置

4.构建含有大插入片断的基因组文库（BAC，YAC）

5.以目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库

6.阳性克隆构建目的基因的跨叠群（Contig）

7.通过染色体步移、登陆、跳查获得含有目标基因的大片断克隆

8.通过亚克隆获得含有目的基因的小片断克隆

9.通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的序列。