第6章_植物基因工程

农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。
(3)基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研 究。
第六章 植物基因工程
第三节 转化子细胞的筛选
当采用某种转基因方法处理外植体后，通 常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转 化
只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选 择到转化细胞。 一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外， 大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。
这种蓝玫瑰是转基因玫瑰，被植入 三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素 产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝 色。
蓝玫瑰由日本三得利公司澳大利亚 分支机构研究培育。完成蓝玫瑰在 自然环境中的生长实验和研究后， 三得利公司计划明年秋季把蓝玫瑰 推向市场，预计市场规模可达数百 亿日元。
向小麦插入一种来自烟曲 霉（Aspergillus fumigatus）的肌醇六磷酸 酶基因，这种小麦的肌醇 六磷酸酶最高可以在89摄 氏度的时候保持稳定。
优点：
操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于 各种动植物； 对受体细胞生命活动影响小；
受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化
二
基因枪法（微弹轰击法）
工作原理：
将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然 后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或 组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到 植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因 的转化。
优点：
方法简单、转化率高； 纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性； 对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育； 培养过程无需特殊选择系统。
５激光微束介导的基因转化
原理：
将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照 射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小 孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞， 实现基因的转移。
其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和 G418 卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制 蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能 而阻断真核细胞中的蛋白质合成 新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。
2.庆大霉素抗性基因（gentr）
该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标 记基因
复 制 起 始 区
Ti 质粒的结构与功能 Ti 质粒致瘤的分子机制
损伤的植物根部会分泌出乙酰
丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它 们能诱导Ti质粒上的vir基因以 及根瘤菌染色体上的一个操纵 子表达。vir基因产物将Ti质粒
上的T-DNA单链切下，而根瘤
菌染色体上的操纵子表达产物 则与单链T-DNA结合形成复合 物，后者转化植物根部细胞。
第六章 植物基因工程
第六章 植物基因工程
第一节 植物基因工程的发展现状
植物基因工程
植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作
即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、 遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导 法、基因枪 法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培 养技术
将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中， 并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，
从而使受体获得新性状的技术体系。
转基因植物的理论前景和意义
通过将目的基因导入农作物、园艺作物中， 改变它们的遗传特性，
使植物免受病虫的危害，
或获得抗除草剂的特性， 或改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、 或改变花的形状和颜色， 或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的 抗逆性等
高等植物基因工程的发展历程
转化筛选细胞的方法主要有两种
一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入 能抑制非转化细胞生长的有毒物质如抗生素、除草 剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除 培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只 有转化细胞才能生长繁殖； 另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选 择性培养基中不能生殖，而选择基因可以补偿这种 缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。
原理：
利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细 胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子， 进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某 种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。
案例：转基因烟草
2 脂质体介导基因转化
原理：
利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体，通过 植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源 DNA的脂质体转入受体细胞。
Ti 质粒的结构与功能 T-DNA的染色体整合机制
Ti 质粒的结构与功能 T-DNA的染色体整合机制
1 Ti质粒的改造策略
Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体， 但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程 载体存在着学多障碍：
（1） 质粒过大，造作困难 （2）大型的Ti质粒有多个酶切位点 （3）植物激素类的影响 （4） Ti质粒中存在不起作用的序列 （5） Ti质粒的局限性
动力类型：
火药爆炸力；高压气体；高压放电
操作步骤
（1）制备DNA微弹；
（2）准备靶外植体材料；
（3） DNA微弹轰击；
（4） 培养轰击后的外植体．
转化率影响因素
金属微粒
金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.
DNA沉淀辅助剂
这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用, 但对植物受体细胞也产生一定的伤害.
这种名为肌醇六磷酸酶 （phytase，亦称植酸酶） 的酶可以帮助人体吸收锌 和铁元素。
将细菌基因dhlA和dhlB插入转基因烟草的 基因组中，清除受污染土壤和地下水的卤化 有机污染物。
转基因植物可作为一种生物反应器
生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某 些有机化合物。
转基因植物为人们研究某一基因功能及其 再生长发育中的作用提供了强有力的工具。
1983 年 1994 年 1995 年 2000 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆
迄今为止 世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种 进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红 薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心 菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴
安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
共整合转化程
序
二元整合转化程序
外源基因
植物细胞筛选标记 Kmr
将外源基因克隆在大肠 杆菌 - 农杆菌穿梭质粒 的T-DNA区内； 重组质粒直接转化农杆 菌株，该菌株携带只含
LB
T-DNA
大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒
RB
vir 区不含 T-DNA 区的
Ti辅助质粒；
第六章 植物基因工程
第二节 植物基因工程方法
一 原生质体介导法
概念：
以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外 源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法。
主要方法:
1) PEG介导的基因转化
2) 脂质体（liposome)介导的基因转化
3) 电激法 4) 激光导入法 5) 显微注射法
1 PEG介导的基因转化
2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。
3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的 检测特性。
目前最常用的报告基因有：
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）
氯霉素乙酰转移酶基因
3.荧光素酶基因
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）
gus基因编码ß -葡萄糖苷酸酶
存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能 催化许多ß -葡萄糖苷酸类物质的水解 绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性， 许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性
( tms ) iaa H iaa M ( tmrn Opine LB RB
tms 的编码产物负责：
合成吲哚乙酸
tmr 的编码产物负责：
合成植物分裂素
Vir 区
Ti plasmid
Opine 代 谢 区
tmt 的编码产物负责：
合成氨基酸衍生物 冠瘿碱
它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。
该选择系统目前也有一定的应用，例如矮 牛、烟草和番茄。
3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）
潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植 物都有很强的毒性。
潮霉素林酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使 其失活。
4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）
膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性， 从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。
特点：
转化率高 操作繁琐
技术性高
3 电激法介导基因转化
原理：
利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激 穿孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进 外源 DNA进入原生质体。
特点：
转化率高；操作简便 ；容易造成原生质体损伤。
４显微注射介导的基因转化
原理：
利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞 质或细胞核，从而实现外源基因的转移。
因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌 的报告基因
尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus 基因应用最多。
氯霉素乙酰转移酶基因
该基因来自大肠杆菌转座子Tn9
它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉 素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用， 从而使其失去活性。 真核细胞中不含有氯霉素乙酰转移酶基因，无 该酶的内源活性
农杆菌ori
大肠杆菌筛选标记
以上述重组农杆菌感染 大肠杆菌ori 植物细胞。
农杆菌筛选标记
2 根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的 分子机理
6个步骤：
1）农杆菌对受体的影响
（2）农杆菌附着到植物受体细胞
（3）诱导启动毒性区基因表达 （4）类似接合孔复合体的合成和装配 （5）T-DNA的加工和转运 （6）T-DNA的整合
一、植物基因工程中的选择基因