人脂肪源干细胞分离培养及向成骨细胞的诱导分化
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。
通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。
1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2 偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
（2）蒸馏水冲洗。
（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。
（4）流水冲洗，晾干。
（5）甘油明胶封固。
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。
3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。
【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。
【步骤】（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。
不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养
不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养张扬;刘大诚;杨效宁【摘要】BACKGROUND:After co-culture with osteoblasts, bone marrow stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts. Whether adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts or not? OBJECTIVE:To observe whether adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts. METHODS:Adipose-derived stem cells and osteoblasts were isolated from New Zealand white rabbits. Then, passage 3 adipose-derived stem cells were co-cultured with passage 2 osteoblasts in 10%or 5%fetal bovine serum for 14 days. RESULTS AND CONCLUSION:After 7 days of co-culture, some adipose-derived stem cells became round in the two groups. After 14 days of co-culture, adipose-derived stem cells highly differentiated and differentiated cells were similar to mature osteoblasts that were positive for alkaline phosphatase staining and alizarin red staining. The mRNA expression of type I col agen and osteocalcin increased in both two group, especial y in the 10%fetal bovine serum group. These findings indicate that adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts induced by high-concentration serum culture.%背景：成骨细胞与骨髓干细胞共培养后可以诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，成骨细胞与脂肪干细胞共培养是否也能诱导向成骨细胞分化呢？目的：观察脂肪干细胞与成骨细胞共培养后能否向成骨细胞分化。
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。
干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。
在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。
在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。
干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。
二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。
2. 定向诱导干细胞分化。
3. 成长曲线测定。
4. 诱导分化后细胞鉴定。
5. 结果统计分析。
Choukroun’SPRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响
差异均有统计 学意义（ Ｐ ＜ Ｏ ． Ｏ １ ） 。 Ａ Ｌ Ｐ活性检测示 Ｐ Ｒ Ｆ组 Ｉ Ｉ 第７ 天、 １ ４天、 ２ １ 天、 ２ ８天细胞活性较对 照组 Ｉ Ｉ 均大 ， 两组比较 差异均 有统计 学意义（ Ｐ ＜ ０ ． ０ １ ） 。Ｐ Ｒ Ｆ组 Ｉ Ｉ 成骨诱导 ７ 天后 ｖ ｏ ｎ Ｋ ｏ ｓ ｓ ａ染 色阳性 ； １ ４天后 阳性 细胞增 多， 对照组 Ｉ Ｉ 诱导 ７天未见钙 结 节， １ ４ 天见少量阳性钙结节 ， 空白组培养 １ ４ 天未见黑 色钙结节 。 结论 ： Ｃ ｈ ｏ ｕ ｋ ｒ ｏ ｕ ｎ ｓ Ｐ Ｒ Ｆ明显促进脂肪干细胞增殖及成骨分化 ， 为骨组织工程提供 了新 的技术。Ｐ Ｒ Ｆ与干 细胞共 同培 养可 能还有许多潜在 的， 临床及生物工程应用价值 ， 值得进一步研 究。 ［ 关键词］自体 Ｐ Ｒ Ｆ ； 人 脂肪 来源干细胞（ Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ ） ； 增殖 ； 成骨分化
ａｄｉ ｐ ＯＳ ｅ — ｄｅｒ ｉ Ｖ ｅｄ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃｅｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ
Ｌ Ｉ Ｕ Ｙｕ ａ ｎ － ｙ ｕａ ｎｌ Ｌ Ｉ Ｕ Ｄａ －ｌ ｉ ｅ ＮＡＮ Ｈｕ ａｆ ＨＵＡＮＧ Ｊ ｉ ａ － ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ． ＳＨＡＮ Ｌ ｅ ｉ
白组 ） 进行培养 ， 第７ 天、 １ ４ 天、 ２ １ 天、 ２ ８天行碱 性磷酸酶活 性（ Ａ Ｌ Ｐ 活性 ） 检测 ； 诱导 细胞培 养后第 ７ 天、 １ ４ 天 天各 组分别行 ｖ ｏ ｎ Ｋ ｏ ｓ ｓ ａ 染色观察钙结节形成情 况。结果： 第３ 代Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ 倒置显微镜 下观 察大多呈梭形 ， 向骨细胞 、 脂肪细胞 、 神 经干细胞定
茶多酚对人脂肪来源间充质干细胞成骨分化的影响
茶多酚对人脂肪来源间充质干细胞成骨分化的影响王华1，齐玉成-杨云芳-赵艺洋2,王慧1，陈培1，杨旭芳1(1.牡丹江医学院，黑龙江牡丹江157011；2.南方医科大学第一临床医学院，广东广州510515)摘要：目的探讨茶多酚(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchy^-mal stem cells,hADSCs)成骨分化的影响。
方法利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs,倒置显微镜下观察各代hADSCs的形态学特点;利用流式细胞术检测各代hADSCs免疫学表型;取P3代细胞进行成骨诱导分化，实验分三组，即未诱导组、常规成骨诱导组与EGCG组(常规成骨诱导+5^mol/L EGCG),14d后，镜下观察细胞形态学改变及碱性磷酸酶(ALP)染色。
结果体外分离、培养的hADSCs形态均一;流式细胞术结果显示hADSCs具备间充质干细胞的免疫学表型，即CD44、CD73、CD105阳性;成骨诱导14d后部分细胞由长梭形变成多角形，细胞呈现聚集趋势；ALP染色显示EGCG组呈强阳性。
结论成功的从脂肪组织中分离培养出了hADSCs,EGCG能加强其成骨分化能力，这将为骨质疏松症的临床药物开发提供新的思路，亦为组织工程骨的构建提供丰富可靠的种子细胞来源。
关键词：EGCG；人脂肪来源间充质干细胞;成骨分化中图分类号：R595.2文献标识码：A文章编号：1001-7550(2021)01-0001-04Effect of EGCG on osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cellsWANG Hua et al(Mudanjiang Medical University,Mudanjiang157011,China)Abstract:Objective To explore the effect of tea polyphenol EGCG on the osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells(hADSCs) .Methods To isolate,culture and amplify hADSCs from human adipose tissue by collagenase digestion and adherent screening methods, the morphological characteristics of each passage of hADSCs were observed under an inverted microscope.The immunophenotype of each generation of hADSCs was detected by flow-cytometry.P3passage cells were taken for osteogenic induction and differentiation,and were divided into three groups:non-induced group, conventional osteogenic induction group and EGCG group(conventional osteogenic induction with+5Rmol/L EGCG).After14days,morphological changes and alkaline phosphatase(ALP)staining were observed under the microscope.Results The morphology of hADSCs isolated and cultured in vitro was uni-form.The results of flow cytometry showed that hADSCs had the immunophenotype of mesenchymal stem cells,such as CD44,CD73and CD105.After14days of osteogenic induction,some cells changed from long spindle shape to polygonal shape,and the cells showed aggregation trend.ALP staining showed strong positive in EGCG group.Conclusion hADSCs have been successfully isolated and cultured from adipose tissue.EGCG can enhance the osteogenic differentiation ability of hADSCs,which will provide a new idea for the clinical drug development of osteoporosis and provide an abundant and reliable source of seed cells for the construction of tissue-engineered bone.Key words:EGCG;human adipose-derived mesenchymal stem cells；osteogenic differentiation随着人口老龄化,骨质疏松症已成为影响人们生活质量的主要因素之一⑷。
脂肪组织干细胞的研究进展
脂肪组织干细胞的研究进展杨立业;黄天华【摘要】脂肪组织中存在多能的干细胞,在体外可以长期增殖,在一定的条件下能够分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞、心肌细胞和平滑肌细胞,是一种新的组织工程和细胞移植的干细胞来源.本文综述了脂肪组织干细胞的培养、向多种方向分化和动物实验的研究进展.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2007(019)002【总页数】3页(P162-164)【关键词】干细胞;脂肪;分化【作者】杨立业;黄天华【作者单位】汕头大学医学院生物学教研室,广东,汕头,515041;汕头大学医学院生物学教研室,广东,汕头,515041【正文语种】中文【中图分类】R338.1组织工程的一个研究重点是种子细胞的来源问题，自体的多能干细胞应用到临床能够治疗疾病，造血干细胞是最早应用到临床的干细胞。
组织工程的一种细胞来源是骨髓基质，骨髓腔中含有几种细胞成分，包括间充质干细胞（mesenchyml stem cells，MSCs），它能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞，是目前骨和软骨组织工程的主要细胞来源[1]。
然而它的自体获得也受到一些条件的限制，并且一次骨穿获得的细胞数量有限。
另外一种潜在的自体干细胞来源是脂肪组织，它的获取可在局麻下进行，对病人的损伤较小。
脂肪来源的干细胞目前可称为脂肪来源的基质细胞（adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs），能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞和平滑肌细胞[2-6]。
人类、大鼠和小鼠的ADSCs细胞培养方法相同[1，4，6]。
首先，获取的脂肪组织用缓冲液反复冲洗，剪刀剪碎，0.075%的胶原酶37℃消化30～50 min，800 g离心10 min，沉淀成分为基质血管层（stromal vascular fraction，SVF），DMEM培养基重悬细胞，筛网过滤离心，弃上清。
脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化
脂肪源性干细胞体外分离培养及向内皮祖细胞的诱导分化刘子琪;孙同文;万有栋;姚瑞;阚全程【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)032【摘要】BACKGROUND:Adipose-derived stem cels are regarded as the potential seed cels for tissue engineering. Colagenase digestion is used to isolate adipose-derived stem cels from fat pads currently. However, there are some problems, such as cumbersome operation and high cost. <br> OBJECTIVE: To study the basic biological characteristics of adipose-derived stem cels by tissue explants culture and to explore the differentiation potential into osteoblasts, adipocytes and endothelial progenitor cels in vitro. <br> METHODS:Adipose-derived stem cels were isolated by tissue explants technique from the bilateral groin fat pads of rats under aseptic conditions, and cultured in vitro. Cel counting kit-8 was used to detect the proliferative activity, and flow cytometry was employed to analyze the expression of cel surface markers. Passage 4 adipose-derived stem cels were cultured in osteogenic medium, adipogenic medium and endothelial progenitor cel medium for 2-3 weeks, and then the cels were identified.<br> RESULTS AND CONCLUSION:Adipose-derived stem cels that were isolated by tissue explants culture were easily cultured, and after subculture, cels were mainly spindle-shaped and grew in clone-like manner with swirling arrangement. Cels that experienced repeated subcultures stilkept stronger proliferative ability and the cel growth curve was shaped as a parabola. Immunochemical staining analysis revealed that adipose-derived stem cels were positive for CD44, CD90 and CD29, but negative for CD31, CD45. After adipogenic/osteogenic induction, the cels were respectively positive for oil red O staining and alizarin red staining. Induced endothelial progenitor cels were identified with CD34 and the ability to uptake Dil-ac-LDL and FITC-UEA. These findings indicate usingthe using tissue explants culture, high-purity adipose-derived stem cels easy to proliferate can be harvested, highly express stem cels-related antigens, and have the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes and endothelial progenitor cels, which meet the needs of seed cels in tissue engineering research.%背景：脂肪源性干细胞是目前组织工程种子细胞的研究热点，通常采用胶原酶消化脂肪组织来获得，但是存在着操作繁琐，花费高等不足。