脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。
通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
脂肪干细胞运用
ADSCs的分离与纯化关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。
目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。
首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90 min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。
1 200 r／min离心5～10 min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm 接种于50ml培养瓶内。
37℃条件5％的CO 饱和湿度培养箱内培养，2 d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。
经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。
细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。
经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。
由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。
然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。
流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。
ADSCs的生物学特性1.ADSCs的鉴定在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。
用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。
ADSCs分泌多种生长因子在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2 C。
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。
干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。
在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。
在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。
干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。
二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。
2. 定向诱导干细胞分化。
3. 成长曲线测定。
4. 诱导分化后细胞鉴定。
5. 结果统计分析。
脂肪干细胞实验报告
一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。
二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。
2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。
2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。
（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。
（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。
（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。
五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。
2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
TL诱导分化成熟脂肪细胞方案
TL诱导分化成熟脂肪细胞方案为了诱导分化成熟脂肪细胞，需要采取一系列措施来模拟体内脂肪细胞的发育过程。
下面是一个基于胎儿稳定细胞株人类成熟脂肪细胞系（ST-13）的方案，在富含小鼠成年体内碎屑坏死和抗生素的DMEM培养基中进行诱导分化。
1.培养脂肪前体细胞：将ST-13细胞接种于DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2的条件下培养。
培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和生长因子（如胰岛素、肾上腺皮质激素等），以促进细胞增殖和生长。
2. 诱导分化：当细胞生长到80%的密度时，将培养基更换为富含诱导因子的培养基，如胰岛素、胰高血糖素苷（IBMX）和去氧皮质酮（Dex）等。
让细胞在这样的培养基中继续培养48小时。
3.培养终分化脂肪细胞：将细胞培养基更换为富含10%FBS和高浓度胰岛素的DMEM培养基。
这样的培养条件可以帮助细胞继续分化成完全成熟的脂肪细胞。
4. 油红O染色：使用油红O染色方法来检测分化程度。
将细胞固定在4% paraformaldehyde中，然后用60%异丙醇洗涤。
将油红O溶液添加到细胞上，染色20分钟后洗涤。
观察细胞内的红色油滴，这是脂肪细胞特有的特征。
5.RT-qPCR：利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）来测量脂肪细胞特异基因表达水平。
收集分化脂肪细胞，提取总RNA，并合成cDNA。
使用特异性引物检测目标基因的表达水平，如脂肪细胞标记基因PPARγ和C/EBPα等。
6.蛋白质免疫印迹：用免疫印迹方法检测特定蛋白质的表达水平。
收集分化脂肪细胞，提取蛋白质，并进行电泳分离。
将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，然后用特异性抗体检测目标蛋白质的表达水平。
7. 脂肪细胞代谢测定：应用适当的测定方法来评估脂肪细胞代谢特性。
例如，使用改良的AdipoRed（泛素酯类）试剂，它可以选择性地结合脂肪细胞中的甘油三酯，以测定细胞的脂肪含量。
8. 细胞迁移和侵袭实验：测量分化脂肪细胞的迁移和侵袭能力，以评估其功能。
脂肪干细胞培养方法 组织块培养法
脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。
脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。
一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。
2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。
脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。
二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。
2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。
三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。
2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。
通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。
在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。
脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。
希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。
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脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
一、试剂准备
（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：
试剂名称浓度商品信息
1.极限必须培养基
(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L
(SH30021.01B, Hyclone)
2.胎牛血清
（Fetal Bovine Serum，FBS）10%
(ES-009-B, Millipore)
3.青霉素/链霉素
（Penicillin/Streptomycin）1%
（TMS-AB2C, CHEMICON）
4.地塞米松
(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46
(D4902-25MG, Sigma)
5.胰岛素
(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808
(91077C—1g, Sigma)
6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24
( I5879-100MG, Sigma)
7.吲哚美辛
(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79
(I7378—5G, Sigma)
（二）成脂分化诱导液浓储液配制
试剂名称质量浓缩倍数配制方法
1.Stock A
胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃
2.Stock B
青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃
3.Stock C
地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300
保存：-20℃
4.Stock D
胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100
保存：4℃
5.Stock E
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃
6.Stock F
吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100
保存：-20℃
（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）
1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;
2.加1管Stock A（1ml）；
3.加1管Stock B（0.1ml）；
4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；
5.加1管Stock E（0.05ml）；
6.加1管Stock F（0.02ml）；
7.加1管Stock D（0.1ml）；
8.测渗透压，调pH7.2-7.4;
9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
（四）Stromal Medium配制（10ml）【２】：
1.取DMEM8.9ml加入15ml离心管（BD）;
2.加入1管Stock A（1ml）；
3.加入1管Stock B（0.1ml）；
4.调pH7.2-7.4;
5.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
（五）0.5%油红“O”配制【３】
油红“O”0.5 g溶于100ml 无水乙醇（50%），分装备用，使用前0.22μm过滤
二、方法
（一）细胞诱导培养【4】
1.间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂
直超净台；
2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
3.1ml微量移液器吸弃培养液；
4.加入预温PBS，1ml/孔；
5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
6.吸弃PBS；
7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；
8.加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孔，5min，37℃；
9.加入等量Stromal Medium，终止消化；
10.1ml微量移液器彻底吹洗皿底，收集细胞悬液至15ml离心管内；
11.1400rpm,RT,5min;
12.小心取出离心管，吸弃上清；
13.加入Stromal Medium重悬消化下来的细胞；
14.按1× 104个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可
铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔），加入Stromal Medium培养基培养3天，设置对照组（一直使用Stromal Medium培养），空白组（添加DMEM 覆盖皿底即可）；
15.3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）；
16.每2-3天换液一次；
17.诱导2周后，初始脂肪形成时用油红“O”染色进行评估。
（二）油红“O”染色：
1.从培养箱内取出细胞至普通实验台；
2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
3.1ml微量移液器吸弃培养液；
4.加入预温PBS，1ml/孔，；
5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；
6.吸弃PBS；
7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；
8.加入4%多聚甲醛液（覆盖所有细胞即可）固定1h，室温(或4℃过夜)，蒸馏水洗涤3
次；
9.用0.5%的油红“O”染色1h（覆盖所有细胞即可），室温；
10.放入70%的乙醇中分化至间质清晰，然后再用蒸馏水洗涤3次；
11.苏木素染液复染（覆盖所有细胞即可），1-2min，蒸馏水洗涤3次【5】；
12.染色的细胞可以用肉眼在相差显微镜下进行观察确认（为避免皿内干燥影响观察，可留
少许液体，且观察时间不宜超过15min或用甘油封盖后可长时间保存）。
三、结果
脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。
小鼠脂肪组织来源的脂肪干细胞（经成脂诱导2周后）
脂肪细胞油红O染色（X200）【6】
【1】【5】Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz
HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for Cell-Based therapies, Tissue Eng. 2001,7(2):211–228.
【２】【4】Yu G, Wu X, Kilroy G, Halvorsen YD, Gimble JM, Floyd ZE.
Isolation of murine adipose-derived stem cells. Methods Mol Biol. 2011;702:29-36.
【３】田玉旺，李琳，李丽，胡海. 介绍一种改良的油红O脂肪染色法，中国组织化学与细胞化学杂志，2007,16(6).
【6】Lu F, Gao JH, Ogawa R, Mizuro H, Hykusoku H.Adipose tissues differentiated by
adipose-derived stem cells harvested from transgenic mice. Chin J Traumatol. 2006 Dec;9(6):359-64.。