高效液相色谱法工作原理

第十六章 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件 三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法的主要分离类型
概述
高效液相色谱法（ 高效液相色谱法（HPLC） HPLC）是20世纪 20世纪60 世纪60 年代末70 年代末70年代初发展起来的一种新型分离 70年代初发展起来的一种新型分离 分析技术， 分析技术，随着不断改进与发展， 随着不断改进与发展，目前已 成为应用极为广泛的化学分离分析的重要 手段。 手段。
高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见 图20-1，一般可分为4个主要部分： 个主要部分： 高压输液系统， 高压输液系统，进样系统， 进样系统，分离系 统和检测系统。 统和检测系统。此外还配有辅助装 此外还配有辅助装 置：如梯度淋洗， 如梯度淋洗，自动进样及数据 处理等。 处理等。
高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱 法的最大优点在于高速 法的最大优点在于高速、 高速、高效、 高效、高灵敏 度、高自动化。 高自动化。高速是指在分析速度上 比经典液相色谱法快数百倍。 比经典液相色谱法快数百倍。由于经典 色谱是重力加料， 色谱是重力加料，流出速度极慢； 流出速度极慢；而高 效液相色谱配备了高压输液设备， 效液相色谱配备了高压输液设备，流速 最高可达 103cm·min-1。
（2）液相色谱能完成难度较高的分离 工作，因为： 因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程， 过程，与样品分子无亲和 作用， 作用，样品分子只与固定相相互作用。 作用。而 在液相色谱中， 在液相色谱中，流动相液体也与固定相争 夺样品分子， 样品分子，为提高选择性增加了一个因 素。也可选用不同比例的两种或两种以上 的液体作流动相， 的液体作流动相，增大分离的选择性。

根据分离机制不同， 根据分离机制不同，液相色谱可分 为：液固吸附色谱、 液固吸附色谱、液液分配色谱、 液液分配色谱、化 合键合色谱、 合键合色谱、离子交换色谱以及分子排 阻色谱等类型。
它是在经典液相色谱基础上， 它是在经典液相色谱基础上，引入了气 相色谱的理论， 相色谱的理论，在技术上采用了高压 在技术上采用了高压 泵、高效固定相和高灵敏度检测器， 高效固定相和高灵敏度检测器，因 而具备速度快 而具备速度快、 速度快、效率高、 效率高、灵敏度高、 灵敏度高、操 作自动化的特点。 作自动化的特点。为了更好地了解高效 液相色谱法优越性， 液相色谱法优越性，现从两方面进行比 较：
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、 相中的吸附能力、分配系数、 分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 色谱分离的实质是样品分子 色谱分离的实质是样品分子（ 是样品分子（以下称 溶质） 溶质）与溶剂 与溶剂（即流动相或洗脱液） 即流动相或洗脱液）以 及固定相分子间的作用， 及固定相分子间的作用，作用力的大 小，决定色谱过程的保留行为。 决定色谱过程的保留行为。
②液相色谱固定相类型多， 液相色谱固定相类型多，如离子交换色 谱和排阻色谱。 谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余 地大； 不可能的。 地大 ；而气相色谱并不可能的 。 ③ 液相色谱通常在室温下操作， 下操作，较低的 温度，一般有利于色谱分离条件的选 择。
（3）由于液体的扩散性比气体的小 105倍，因此，溶质在液相中的传质速率 慢，柱外效应就显得特别重要； 重要；而在气 相色谱中， 相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不 计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收 样品也比较容易，而且回收是定量的， 适合于大量制备。 制备。但液相色谱尚缺乏通 用的检测器， 用的检测器，仪器比较复杂，价格昂 贵。在实际应用中， 应用中，这两种色谱技术是 互相补充的。
目前高效液相色谱法已被广泛 应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白 质 、 核酸、 核酸 、 氨基酸、 氨基酸、 多糖类、 多糖类 、植物 色素、 色素 、 高聚物、 高聚物 、 染料及药物等 染料及药物等物质 药物等物质 的分离和分析。 的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费 用昂贵， 用昂贵 ， 操作严格， 操作严格， 这是它的主要 缺点。 缺点。
高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象 气相色谱法分析对象只限于分 分析对象只限于分 析气体和沸点较低的化合物， 析气体和沸点较低的化合物，它们仅占 有机物总数的20 有机物总数的20％。 20％。对于占有机物总数 ％。对于占有机物总数 近80％ 80％的那些高沸点、 的那些高沸点、热稳定性差、 定性差、摩 尔质量大的物质， 大的物质，目前主要采用高效液 相色谱法进行分离和分析。 相色谱法进行分离和分析。
一、液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样， 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也 由两相——固定相和流动相组成。 固定相和流动相组成。液相 色谱的固定相可以是吸附剂、 色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合 固定相（ 固定相（或在惰性载体表面涂上一层液 膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶 ）、离子交换树脂或多孔性凝胶； 离子交换树脂或多孔性凝胶；流 动相是各种溶剂。 动相是各种溶剂。
例如分离苯的羟基化合物， 例如分离苯的羟基化合物，7个组分 只需1min就可完成。 就可完成。 对氨基酸分离， 对氨基酸分离，用经典色谱法， 用经典色谱法，柱长约 170cm，柱径0.9cm，流动相速度为 30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出 多小时才能分离出20 种氨基酸； 种氨基酸；而用高效液相色谱法， 而用高效液相色谱法，只需 lh之内即可完成。 之内即可完成。 又如用25cm× 0.46 cm 的Lichrosorb －ODS(5μ)的柱， 的柱，采用梯度洗脱， 采用梯度洗脱，可在 不到0.5h内分离出尿中104个组分。 个组分。