实验四 病原性球菌
实验四 化脓性球菌和肠道杆菌的病原学检测(1)
肺炎球菌
pneumococcus
G+双球菌，致病株有荚膜
脑膜炎球菌
meningococcus
G－双球菌
淋球菌
gonococcus
G－双球菌
巧克力平皿，5-10%CO2， 37℃24-48h，菌落小， 呈灰白色。
血浆凝固酶试验
玻片法 ① 取洁净载玻片一张，两端各加生理盐水一滴。 ② 灭菌接种环自血琼脂平板上挑取两种葡萄球 菌培养物少许，分别混悬于玻片上的生理盐水 成均匀的细菌悬液，观察有无自凝现象。 ③ 于每滴细菌悬液内，各加入兔血浆1d，混匀。 ④ 数秒后观察结果，若细菌呈颗粒状凝集时为 (+)，若无凝集时为(-)。
金葡菌 表葡菌 金黄色 ＋ ＋ ＋ 强 白色 － － － 弱或无
腐生葡萄球菌 白色或柠檬色 － － － 无
鉴别肺炎球菌与甲链
菊糖分解 胆汁溶菌实验
本次实验课结束
交作业，值日同学留下 下周再见！
G+球菌，呈葡萄串状排列
葡萄球菌
金黄色葡萄 球菌 血平 皿培 养基 白色葡萄球 菌 柠檬色葡萄 球菌
staphylococcus
金黄色色素 白色色素 柠檬色色素 致病力强 条件致病菌 条件致病菌
链球菌
streptococus
G+球菌，呈链状排列
链球菌
streptococus
血平 甲型溶血链球菌（草绿色溶血环） 皿培 乙型溶血链球菌 (无色溶血环) 养基 丙型溶血链球菌 (无溶血环)
微生物学试验
实验四 化脓性球菌和 肠道杆菌的病原学检测（1）
实验目的要求
1.掌握常见化脓性球菌的形态染色
特点 2.熟悉常见化脓性球菌的培养特征 3.熟悉血浆凝固酶试验、触酶试验 及抗“O”试验的原理、方法、结果 及意义 4.了解常见化脓性球菌的致病特点
医学微生物学实验报告
医学微生物学实验报告（本科）实验室：姓名：学号：班级：海南医学院微生物学与免疫学教研室编写二OO四年四月第一次实验【实验内容】实验一微生物的形态与结构的观察实验二微生物的分布【结果记录及判定】实验一微生物的形态与结构的观察1、细菌正常形态及特殊结构的观察及记录（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：特殊结构：霍乱弧菌破伤风梭菌芽胞形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：肺炎链球菌荚膜伤寒沙门菌鞭毛形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：炭疽杆菌脑膜炎球菌2、病毒包涵体观察及记录（示教）：绘图并描述描述：狂犬病毒包涵体（H-E染色）3、真菌的形态观察及记录（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：白假丝酵母菌皮肤癣菌4、革兰染色法结果观察及记录：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：葡萄球菌大肠埃希菌实验二微生物的分布结果记录：1、空气中的细菌种类（种）：数量（个）：2、水中细菌数检测（1）自来水中细菌的种类（种）：数量（个）：（2）污水中细菌的种类（种）：数量（个）：3、物品和手指上的细菌检查（记录本人结果）物品表面的细菌种类（种）：数量（个）：手指表面的细菌种类（种）：数量（个）：结论：成绩：_________________批改教师签名：____________批改时间：________________第二次实验【实验内容】实验三微生物的分离培养实验四抗菌药物敏感性试验实验五消毒、灭菌、除菌【结果记录及判定】实验三微生物的培养1、细菌分离培养方法（分区划线接种法），生长现象为：2、纯种细菌接种技术（1）琼脂斜面接种培养，大肠埃希菌生长现象：（2）液体培养基接种法，大肠埃希菌生长现象：（3）半固体培养基接种技术①标本名称：大肠埃希菌半固体培养基②标本名称：痢疾志贺菌半固体培养基穿刺线：穿刺线：培养基：培养基：结论：结论：3、沙保弱琼脂平板上的真菌菌落观察及描述（示教）：类酵母型菌落：丝状菌落：实验四抗菌药物敏感性试验实验五消毒、灭菌、除菌一、紫外线灭菌法（示教）玻璃盖遮住平板的一半现象：现象：分析：分析：二、机械除菌法（示教）：1、未经过滤的液体培养基培养后的现象：2、经过过滤的液体培养基培养后的现象：分析：成绩：_________________批改教师签名：____________第三次实验【实验内容】实验六细菌的致病性实验七化脓性感染的细菌学检查【结果记录及分析】实验六细菌的致病性一、透明质酸酶试验（示教，实验动物：家兔）测量试验侧与对照测的黑墨水扩散范围（cm×cm）：实验侧：对照侧：分析：二、破伤风外毒素的毒素作用（实验动物：小鼠）实验现象：实验侧：对照侧：分析：实验七化脓性感染的细菌学检查一、病原性球菌的形态观察（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：葡萄球菌链球菌形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌二、病原性球菌的鉴别：三、血清学试验抗“O”试验（乳胶凝集法）实验现象：阳性对照：阴性对照：标本1：标本2：结果判定：标本1为________，标本2为_________。
主要的病原性细菌
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3、抗原
链球菌分为20个血清群。 与致病性有关的Ｍ蛋白（细胞壁的蛋白质抗原）
主要见于Ａ群链球菌。根据M蛋白不同，将A群链球 菌分为６０多个血清型。
M蛋白与致病性及免疫原性有关
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4、分类
链球菌在血琼脂平板上的溶血现象在鉴定链球菌的致 病性方面有一定的意义。
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产溶血素，菌落周围呈明显的β溶血。
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5、毒素和酶
金色葡萄球菌可产生多种毒素和酶，故致病性强。常引起化 脓性疾病和毒素性疾病。
（1 ）毒素
A．溶血素：具有溶血作用，是金黄色葡萄球菌的重要致病物质。 B．杀白细胞素：损伤中性粒细胞和巨噬细胞。 C．肠毒素：引起人胃肠炎和食物中毒。肠毒素耐热，100℃ 30min仍有毒
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第五节 炭疽芽孢杆菌
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一、所致疾病
炭疽杆菌(炭疽芽孢杆菌)，可引致多种 动物的炭疽，其中草食兽最易感，犬、猫、 食肉兽等则有相当大的抵抗力，禽类一般不 感染。
食草动物——急性败血症 猪——慢性的咽部局限感染 犬、猫和食肉兽——肠炭疽
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二、主要生物学性状
1、形态及染色特性
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一、所致疾病
致病性大肠杆菌能引起动物的大肠杆菌病。 猪：仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病。 鸡：发生急性败血症、气囊炎、关节滑膜炎、眼球炎、
脐炎、输卵管炎和腹膜炎等。
大肠杆菌在公共卫生、食品卫生学上，常用作被粪便 污染的检验指标。
球菌
SPA
葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）
概念：是存在于金黄色葡萄球菌细胞壁表
面的一种蛋白质. 特点:能与人及多种哺乳动物的IgG Fc段 非特异性结合. 生物学意义：抗吞噬、促细胞分裂、引起 变态反应、损伤血小板等作用. 用途：协同凝集试验.
毒素性疾病
食物中毒 烫伤样皮肤综合征(SSSS) 毒性休克综合征(TSS)
假膜性肠炎
三、免疫性
人类有一定的天然免疫力，只有
当皮肤黏膜受伤后，宿主免疫力降低 时，才易引起葡萄球菌感染。 感染后能获得一定的免疫力，但 不强，难以防止再次感染。
微生物学检查
直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性 观察菌落性状、溶血性、色素 涂片、染色、镜检 挑取可疑菌落 生化反应测定 纯培养 致病性测定
4. 肠毒素：
是一组热稳定的可溶性蛋白， 耐100℃ 30min；
抗胃蛋白酶分解； 刺激呕吐中枢，导致以呕吐
为主要症状的食物中毒
常污染食物有牛奶、肉类等
5. 表皮剥脱毒素：
使表皮层细胞脱落，引起剥脱性皮炎
裂解表皮组织的棘状颗粒层
表 皮与真皮脱离
烫伤样皮肤综合征
6. 毒性休克综合征毒素-1（ TSST-1） （toxic shock syndrom toxin 1）
抗吞噬：
（体内作用）
SPA
抗体
金葡菌
协同凝集实验： 未知Ag(病原菌)
（体外作用）
金葡菌
抗体
SPA
分 类：
金黄色葡萄球菌（致病菌） 产生色素
表皮葡萄球菌（条件致病菌）
腐生葡萄球菌
产生凝固酶 噬菌体分型
实验四病原性球菌
凝集物可被涂散，变阴性。
阳性对照 阴性对照 待测血清 各加溶血素“O” 1滴轻摇1min 再加SLO胶乳1滴轻摇3min 观察成果
成果鉴定：
稀释度
ASO （IU/ml）
1：15 1：30 1：60
400 800 1600
ASO≤250 IU/ml 阴性
注意事项：
1. 液体量要一样，菌量一样。 2. 血浆多挑几环（一滴旳量），菌少挑点，
表3
甲型链球菌 乙型链球菌
血平板 针尖小菌落、草绿色狭窄溶血环 针尖小菌落、透明宽敞溶血环
3. 血浆凝固酶试验--玻片法 （操作，1人/组）
原理：
措施：
1
2
3
兔血浆
+ 金葡
兔血浆
+ 白葡
生理盐水
+ 金葡
凝集（+） 不凝集（-） 不凝集（-）
4、血浆凝固酶试验（试管法） 示教
凝 集 为 阳 性
金葡菌
Байду номын сангаас
白葡菌
+
+
兔血浆
兔血浆
37℃30′水浴观察
不 凝 集 为 阴 性
凝固酶试验 （试管法）
五、抗链球菌溶血素“O”（ASO） 迅速胶乳法 （操作，1人/组）
原理： 高滴度病人血清被适量溶血素中和了正常水平
旳抗体后，还有多出ASO，这些多出抗体即与SLO胶乳 试剂反应，出现清楚、均匀旳凝集颗粒。
措施：
实验四病原性球菌
1. 五类病原性球菌旳形态、排列及染色性 示教
G+球菌：
金葡菌
链球菌
肺炎双球菌
G-球菌：
实验四病原性球菌的检验
1、标本采集：脓液
2、检验程序：
脓液
↓
↓
直接涂片
分离培养
革兰染色镜检 （操作）（血琼脂平板）
↓
↓ 37℃ 18～24h
初报 挑取可疑菌落（性状、色素、溶血）
↓
鉴定试验及药敏试验
↓
↓
↓
↓
革兰染色镜检 生化反应鉴定 其他鉴定 药敏试验
↓
↓
↓
↓
↓37℃ 18～24h
报告
三、葡萄球菌属生物化学反应：
（一）触酶试验（操作）
规定时间内出现清晰凝集者为阳性，不出现凝集 者为阴性。
主要用于风湿热的辅助诊断：
风湿热患者ASO大多在250单位；
活动性风湿热患者ASO一般≥400单位。
『实验报告』
绘出化脓性球菌镜下形态图。 记录脓液标本的分离培养与鉴定程序。
实验四 病原性球菌的检验
病原性球菌，又称化脓性球菌，根据革 兰染色性的不同，分为两类： G＋球菌： 葡萄球菌、链球菌、肺炎链 球菌等。 G- 球菌： 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌 等。
『目的要求』
掌握：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜 炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌的形态及染色特点；葡 萄球菌、链球菌的菌落特点及链球菌在血琼脂 平板上的溶血性；血浆凝固酶试验、触酶试验 的试验方法、结果及意义。
四、抗链球菌溶血素“O”的测定（乳胶法，示教）
1、原理：ASO高滴度的血清被适量溶血素“O”中 和后，失去了正常水平量的抗体，多余的抗“O” 抗体与ASO乳胶试剂反应，出现肉眼可见的，清 晰均匀的凝集颗粒（ASO乳胶试剂系羧化聚苯乙 烯乳胶与溶血素“O”共价交联的产物）。
2、方法：（略）3、结Fra bibliotek及意义：1、原理：
微生物免疫学实验报告
1实验内容：2显微镜油镜的使用与保护。
3细菌的形态与结构的观察。
4实验目的：5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。
6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。
7熟悉细菌的特殊结构。
8实验材料：显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。
4实验方法：(1)显微镜油镜的使用与保护显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的工具。
因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。
1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。
2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。
对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。
3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。
⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。
⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。
4、显微镜的保护：⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。
⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。
避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。
⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。
置于干燥处，以防受潮。
(二)细菌形态观察1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌2、细菌的特殊结构：荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌鞭毛：水弧菌（周毛菌）一、实验内容：3细菌标本片的制备（操作）4革兰染色法（操作）二、实验目的：1进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。
常见病原性细菌
(2) M蛋白 是A群链球菌的主要致病因子，含M蛋白的链球
菌具有抗吞噬和抵抗细胞内杀菌作用；与某些超敏反 应疾病有关。
(3) 致热外毒素 是人类猩红热的主要毒性物质。
(4) 链球菌溶素 溶解红细胞、破坏白细胞和血小板。 链球菌溶素O（SLO）：对氧敏感。抗原性强，可
刺激机体产生抗体。 链球菌溶素S（SLS）：对氧稳定。无免疫原性。
固体培养基生长现象
β溶血
生化反应 分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气。 致病性菌株分解甘露醇。 触酶阳性（与链球菌区分标准）。
抗原 ① 葡萄球菌A蛋白(SPA)：细胞壁表面蛋白质，完全抗原。
S.aureus
Ab
Ag
协同凝集试验（coagglutination）
② 荚膜多糖：有利于细菌粘附。 ③ 多糖抗原：存在于细胞壁，有群特异性。
三、 奈瑟菌属(Neisseria)
G-，双球菌，无鞭毛、芽胞，有荚膜和菌毛。 专性需氧。
脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌
脑膜炎奈瑟菌
G-,双球菌，肾形或豆形，无鞭毛、芽胞，有菌毛和荚膜。 培养特性
营养要求高 巧克力培养基 专性需氧 产生自溶酶
抗原结构 荚膜多糖群特异性抗原: 分群 外膜蛋白型特异性抗原: 分型 脂寡糖抗原：主要致病物质
根据溶血现象分为3类
类别 甲型溶血性链球菌
草绿色链球菌
溶血环现象 草绿色溶血环
名称
致病性
溶血 多为条件致病菌
乙型溶血性链球菌 溶血性链球菌
透明无色溶血环
溶血
致病力强
丙型链球菌 不溶血性链球菌
不溶血
无致病性
A群链球菌
球形或椭圆形，链状排列，G＋，无芽胞，无鞭毛，培养 早期形成透明质酸的荚膜。
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方法：
阳性对照 阴性对照 待测血清 各加溶血素“O” 1滴轻摇1min 再加SLO胶乳1滴轻摇3min
观察结果
整理版
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结果判定：
稀释度
ASO （IU/ml）
1：15 1：30 1：60
400 800 1600
ASO≤250 IU/ml 阴性
整理版11Fra bibliotek 注意事项：1. 液体量要一样，菌量一样。 2. 血浆多挑几环（一滴的量），菌少挑点，
实验四 病原性球菌
1. 五类病原性球菌的形态、排列及染色性 示教 2. 葡萄球菌、链球菌的培养物 示教 3. 血浆凝固酶试验--玻片法 （操作，1人/组）
试管法 示教 4、抗链球菌溶血素”O”（ASO）乳胶试验 示教 5、脓汁中葡萄球菌的分离鉴定 （操作，1人/组）
整理版
1
1. 五类病原性球菌的形态、排列及染色性 示教
兔血浆
性
37℃30′水浴观察
整理版
不 凝 集 为 阴 性
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凝固酶实验 （试管法）
整理版
8
五、抗链球菌溶血素“O”（ASO） 快速胶乳法 （操作，1人/组）
原理： 高滴度病人血清被适量溶血素中和了正常水平
的抗体后，还有多余ASO，这些多余抗体即与SLO胶乳 试剂反应，出现清晰、均匀的凝集颗粒。
整理版
G+球菌：
金葡菌
链球菌
整理版
肺炎双球菌
2
G-球菌：
淋球菌
脑膜炎球菌
整理版
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2. 葡萄球菌、链球菌的培养物 示教
表1
金葡 柠葡 白葡
普通琼脂平板
菌落形状
色素
圆形凸起光滑中等大小 金黄色
同上
柠檬色
同上
白色
血平板 溶血性
+ -
整理版
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表2 脑膜炎双球菌
巧克力血平板 菌落透明似露滴状
表3
甲型链球菌 乙型链球菌
不能干。 3. 涂菌时间一样，出现凝集为阳性，再涂
凝集物可被涂散，变阴性。
整理版
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血平板 针尖小菌落、草绿色狭窄溶血环 针尖小菌落、透明宽大溶血环
整理版
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3. 血浆凝固酶试验--玻片法 （操作，1人/组）
原理：
方法：
1
2
3
兔血浆
+ 金葡
兔血浆
+ 白葡
生理盐水
+ 金葡
凝集（+）整理不版凝集（-） 不凝集（-）
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4、血浆凝固酶试验（试管法） 示教
凝 集 金葡菌
白葡菌
为+
+
阳 兔血浆