利用小RNA深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原
侵染中国河北大豆的大豆花叶病毒的鉴定和全基因组序列分析
侵染中国河北大豆的大豆花叶病毒的鉴定和全基因组序列分析作者：杨菲张明振周雪平李方方来源：《植物保护》2024年第04期关键词大豆花叶病毒；小RNA深度测序；基因组序列大起源于我国，已有几千年的种植历史。
由于其蛋白质和油脂含量高，并含有异黄酮等功能性化合物，被用作粮食、油料及饲料。
大豆在生长发育过程中受到多种病原物的危害，其中大豆花叶病毒引起的大豆花叶病是世界上分布范围广泛、对产量和品质影响很大的大豆病害之一。
SMV也是我国三大大豆产区（东北、黄淮海、华南）最常见的大豆病害的病原。
在自然条件下，受SMV侵染的感病大豆品种表现出花叶、褶皱和植株矮化等症状，并导致严重的产量损失。
SMV还可侵染大豆种子，导致种皮斑点及种子质量下降，受病毒侵染的种子次年将成为主要的侵染源。
SMV为马铃薯Y病毒科Potyviridae马铃薯Y病毒属Potyuirus成员，其基因组为约9600个核苷酸组成的正义单链RNA，仅包含一个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码11种成熟蛋白：P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、Nla-Pro、NIb和Cp。
SMV可由蚜虫以非持久型方式传播，还可以通过机械和种子传播。
SMV的寄主范围非常窄，除大豆外，仅在西番莲属PassifLora、决明属Senna、半夏属和豇豆属中有过自然感染的报道。
基于二代测序技术的小RNA测序（small RNAsequencing，sRNA-seq）于2009年出现，并首次被提出可以作为一种通用手段来检测动植物DNA或RNA病毒。
该技术易于发现新病毒或新分离物，已被广泛应用于植物病毒的检测。
本研究利用小RNA深度测序方法在表现病症的大豆叶片上检测到6株SMV分离物，并通过分段克隆方法，获得了SMV全基因组序列并进行了同源性分析，这些为SMV的深入研究提供基础，为SMV病害防控提供依据。
1材料与方法1.1材料来源大豆样品于2022年8月采集自河北省盧龙县农户自营的大豆田块，根据症状分成6组，每组混合作为一个样品，编号为Gm1～Gm6，症状表现为，Gm1：叶肉黄绿相间；Gm2：叶肉黄绿相间并伴有褶皱；Gm3：叶肉密布褪绿黄点；Gm4：叶片严重皱缩、叶边缘下卷、畸形；Gm5：叶片黄绿相间、皱缩、畸形；Gm6：叶片有凸起、严重褶皱、畸形（图1）。
小RNA测序数据处理和分析流程
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知因无限
介绍
Small RNA是一类重要的体内调节分子，主要包括miRNA、piRNA和siRNA。
可参与基因转录后调控，调节细胞生长、分化，以及个体发育、生殖等重要生物学过程。
Small RNA测序是研究生物样品小RNA的最主要方法之一，首先采用胶分离技术，收集样品中18-30nt 的RNA片段；再利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息。
该项技术可用于以下研究
1.观察疾病发生过程中病灶部位内部miRNA的表达异常，确定与疾病相关miRNA
2.基于小RNA样本的新miRNA预测和新miRNA的调控靶基因预测
数据处理和分析流程图
预期示例图展示
示例1 A图为测序序列分类，B图为每个类别中序列长度分布，C图为miRNA表达水平聚
类
示例2 miRNA、靶基因与miRNA上游TF网络图
示例3 miRNA预测结果示意图。
基于小RNA、sRNA深度测序技术进行病毒鉴定和发现的研究进展_李洋
第３１卷 第４期２ ０ １ ５年７月 病 毒 学 报ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．４Ｊｕｌｙ ２０１５基于小ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）深度测序技术进行病毒鉴定和发现的研究进展李洋，王昊，张晨，马学军＊（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 １０２２０６）摘要：ｓＲＮＡ深度测序技术是２００９年起新兴的可用于病毒研究的组学技术，它突破了传统病毒鉴定技术的局限，直接以宿主中ｓＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）为研究对象，可以快速地鉴定侵染宿主的病毒组成。
是一种发现新病毒，监控病毒变异的有效方法。
人们用这种方法发现了很多有意义的病毒，研究领域涉及到植物、无脊椎动物和人体细胞等，充分显示ｓｉＲＮＡ组学方法应用在病毒鉴定和分类的实用意义。
本文对该方法的主要原理，操作流程及应用进展等方面进行了综述，同时使用公开的ｓＲＮＡ深度测序数据进行了生物信息分析，进一步证实了该方法的可靠性。
关键词：小ＲＮＡ；病毒鉴定；高通量测序中图分类号：Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８７２１（２０１５）０４－０４５７－０６收稿日期：２０１５－０１－２８；修回日期：２０１５－０３－２３基金项目：传染病重大专项（２０１３ＺＸ１０００４－００１，２０１２ＺＸ１０００４－２１５，２０１３ＺＸ１０００４－２０２，２０１３ＺＸ１０００４８０４－００７）作者简介：李洋（１９８９－），男，研究实习员，主要从事下一代测序技术进行多病原体检测的生物信息学方向的研究，Ｔｅｌ：０１０－５８９００８１２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙａｎｇ＠ｉｖｄｃ．ｃｈｉｎａｃｄｃ．ｃｎ＊通讯作者：马学军（１９６６－），研究员，博士生导师，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：０１０－５８９００８１０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｘｊ＠ｉｖｄｃ．ｃｈｉｎａｃｄｃ．ｃｎ 当不明原因疫情在某个国家或者地区出现时，在第一时间对病原体进行准确的鉴定分类是传染病应急防控能力和水平的标志［１］。
利用小RNA 深度测序技术鉴定白芷病毒病病原
2023山西农业大学学报（自然科学版）1 材料和方法1.1 试验材料2021年7月从山西农业大学药用植物园内采集3份表现为花叶、褪绿等疑似病毒病症状的白芷叶片，液氮速冻后保存于−80 ℃冰箱（图1）。
主要试剂：RNA Easy Fast 植物组织RNA 快速提取试剂盒（天根生化科技有限公司）； First -Strand cDNA Synthesis SuperMix ，2×Taq PCR Mix ，pEASY -T1 Cloning Kit （北京全式金生物技术股份有限公司）；Gel Extraction Kit （OMEGA 公司）；DL 2000 DNA Marker ，DL 5000 DNA Marker （Takara 公司）。
1.2 试验方法1.2.1 植物总RNA 提取及高通量测序选取白芷幼嫩叶片参照植物RNA 快速提取试剂盒说明书进行总RNA 的提取，提取的RNA 经检测合格后送至广州基迪奥生物科技有限公司进行高通量测序。
1.2.2 RT‐PCR 检测、克隆测序根据小RNA 测序获得的CMV 核苷酸拼接序列，并结合前人的研究结果，设计了扩增CMV 的2个编码基因（CP 、MP ）引物（表1）进行克隆。
试验反应体系及流程参考牛颜冰等［7］的方法进行。
扩增产物经电泳回收后连接至pEASY -T1 Cloning Kit 克隆载体，挑选阳性单克隆送至生工生物工程股份有限公司测序。
1.3 序列测定及分析将测序获得的CMV CP 、MP 基因序列利用NCBI 中的BLAST （https ：///Blast.）进行同源比对分析，再使用DNA‐MAN 7.0软件进行序列相似性比较，使用MEGA 7.0软件以邻接法（Neighbor -joining ）构建系统进化树，可信度设置为1000次自导复制验证。
2 结果与分析2.1 小RNA 测序结果与分析对采集的白芷样品进行小RNA 深度测序，共获得22 158 005个原始序列（raw reads ），将raw reads 中接头序列、没有插入的序列等不同的低质量序列去除后共获得长度在18~28 nt 的clean reads 数为19 894 844，占clean reads 的百分比达到89.79%。
基于小RNA_深度测序技术的苜蓿病毒病鉴定与分析
第 32 卷第 12 期Vol.32，No.12115-1252023 年 12 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA杜江，马振男，王晨燕，等. 基于小RNA深度测序技术的苜蓿病毒病鉴定与分析. 草业学报， 2023， 32（12）： 115−125.DU Jiang， MA Zhen-nan， WANG Chen-yan，et al. Identification and analysis of alfalfa virus disease based on sRNA deep sequencing technology. Acta Prataculturae Sinica， 2023， 32（12）： 115−125.基于小RNA深度测序技术的苜蓿病毒病鉴定与分析杜江1，马振男1，王晨燕1，张丽2，王德富1，牛颜冰1*（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学草业学院，山西太谷 030801）摘要：紫花苜蓿是一种重要的牧草，然而紫花苜蓿病毒病的侵染严重影响其品质。
本研究通过小RNA深度测序技术和RT-PCR/PCR的方法对采自山西农业大学植物园中表现花叶、皱缩、卷曲的紫花苜蓿样品进行病毒病原的鉴定，结果表明病样被苜蓿花叶病毒（AMV）、豌豆线条病毒（PeSV）、苜蓿矮化病毒（ADV）和苜蓿卷叶病毒（ALCV）4种病毒复合侵染。
PCR扩增获得了ALCV山西太谷紫花苜蓿分离物SXTG（OP748371）的全基因组序列，分析表明该分离物与ALCV阿根廷紫花苜蓿分离物Colonia Dora（MG792026）的序列相似性最高，达到97.34%。
对扩增获得的AMV CP基因（OP748369）核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行序列比对分析显示，AMV山西太谷紫花苜蓿分离物SX与阿根廷紫花苜蓿AMV分离物ACat（MW835977）相似性最高，核苷酸和氨基酸相似性分别为99.24%和99.54%。
毛竹小RNA高通量测序及病毒分析
毛竹小RNA高通量测序及病毒分析范春节;王晖;卢孟柱【期刊名称】《林业科学研究》【年(卷),期】2014(027)003【摘要】以毛竹叶片为材料,采用小RNA高通量测序结合生物信息学对小RNA数据库进行组装,进一步分析了毛竹中存在的病毒和类病毒,并采用RT-PCR和RACE 进行验证.结果表明:在竹子样品中存在水稻东格鲁病毒(RT-BV),覆盖率达到91.0％.在毛竹样品中扩增得到1 992 bp RTBV病毒类似序列,占其基因组的24.9％.RTBV 病毒在多个毛竹样品中存在且不存在多态性.RTBV病毒可能是一个古老的植物病毒,在进化过程中禾本科植物将其序列整合到基因组中来防御RTBV病毒的浸染.【总页数】6页(P335-340)【作者】范春节;王晖;卢孟柱【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所,林木遗传育种国家重点实验室,北京100091;中国林业科学研究院热带林业研究所,广东广州 510520;中国林业科学研究院林业研究所,林木遗传育种国家重点实验室,北京100091;NERC/Centre for Ecology and Hydrology(CEH)Oxford,Mansfield Road,Oxford OX1 3SR,UK;中国林业科学研究院林业研究所,林木遗传育种国家重点实验室,北京100091【正文语种】中文【中图分类】S795.7【相关文献】1.小RNA高通量测序数据分析方法 [J], 彭骅;李佛生;王胜华2.牦牛卵巢小RNA高通量测序及生物信息学分析 [J], 熊显荣;兰道亮;李键;字向东;林亚秋;马力3.高通量测序技术检测非典型子宫内膜增生疾病微小RNA的差异表达 [J], 唐世倩; 褚春芳; 李婷; 郑萍; 周琦; 刘菊红; 王玉4.日本血吸虫虫卵分泌物小RNA的高通量测序 [J], 徐桂娜; 何雪梅; 周晓蓉; 曾凡胜; 秦志强5.玛瑙红樱桃病毒病小RNA的高通量测序检测 [J], 洪怡;文壮;田田;文晓鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于小RNA_深度测序的烟草脉坏死病病原分子鉴定及其全基因组序列分析
·1387·基于小RNA 深度测序的烟草脉坏死病病原分子鉴定及其全基因组序列分析莫翠萍1，陈锦清1，韦学平2，崔丽贤1，罗婉笛1，3，李金哲1，3，谢慧婷1，秦碧霞1，蔡健和1*，李战彪1*（1广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁530007；2广西烟草公司百色市公司，广西百色533000；3长江大学农学院，湖北荆州434000）摘要：【目的】明确引起广西河池市南丹县烟草呈现斑驳花叶、叶脉坏死等症状的病毒病原，为烟草病毒病的综合防治提供理论依据。
【方法】2022年5月，从河池市南丹县采集5份表现叶脉坏死、花叶等症状的烟草叶片样品，采用小RNA 深度测序技术、反转录PCR （RT-PCR ）、摩擦接种、分段克隆、系统进化及重组分析等方法对样品进行鉴定及遗传进化分析。
【结果】小RNA 深度测序获得与GenBank 数据库中马铃薯Y 病毒（Potato virus Y ，PVY ）不同分离物具有较高核苷酸相似性（99.00%~100.00%）的5条序列，将5条序列拼接后获得1条全长为9708nt 的全基因组序列；通过鉴别寄主苋色藜（Chenopodium amaranticolor ）单斑分离的方法获得单一病毒，利用该分离纯化后的病毒单斑接种普通烟K326和本氏烟，其中K326的新叶产生坏死症状，而本氏烟的新叶呈不规则深绿色病斑症状；分别提取K326和本氏烟的叶片样品总RNA ，通过RT-PCR 检测、分段克隆的方法获得病毒分离物的全基因组序列，结果显示2个烟草品种中的病毒序列与小RNA 深度测序获得的序列相似性达99.90%；将序列在GenBank 中进行BLAST 分析发现，研究获得的序列与已登录GenBank 的PVY 各分离物具有较高的核苷酸相似性，其中与我国黑龙江省马铃薯分离物PVY HLJ26（MF134425）的核苷酸相似性最高，为99.01%，表明研究获得的病毒序列为PVY 分离物，命名为PVY-GXnd1（OP131591）。
一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析
一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析作者：胡逸超卢晓静李璞廖咏梅何新华邹承武陈琦来源：《南方农业学报》2021年第12期摘要：【目的】探究侵染掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA，vsiRNA）序列特征，为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。
【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料，取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA，并进行小RNA 深度测序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列，利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。
【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段（reads），长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度，占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。
该病毒分离物的基因组全长为9735 nt，编码3105个氨基酸，其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%，暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示，SMV NN 与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近。
将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上，分析该病毒的vsiRNA特征，结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度，病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖，且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。
【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4，DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1，AGO1）对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切，主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA，从而抑制SMV在植株体内的复制。
利用siRNA高通量测序技术检测烟草病毒_王芳
1． 5 样本病毒分析
去除低质量，未插入 3' 接头，5' 接头 reads，另 外再除去带 polyA 尾巴的数据，最后选取不小于 18 nt 的 reads。所得的序列去除 3'接头，处理后的 序列用序列组装软件 velvet version 1． 1．
本研究利用小 ＲNA 测序技术研究发现安徽东
Table 1 Ｒesult of virus detection from tobacco library of Dongzhi，Xuancheng and Bozhou
1． 2 血清学检测
采用购自 ADGEN 的 DAS-ELISA 检测试剂盒 对病样进行检测，具体检测方法参照说明书。选用 番茄斑萎病毒（ TSWV） 、马铃薯 Y 病毒（ PVY） 、烟 草饰文病毒（ TEV） 、黄瓜花叶病毒（ CMV） 、烟草花 叶病毒（ TMV） 、烟草脉带花叶病毒（ TVMBV） 和烟 草环斑病毒（ Tobacco ring spot virus，TＲSV） 的抗血 清。样品采用同一烟区的混合样品进行检测。
植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 45（ 1）： 97-100（ 2015）
doi： 10． 13926 / j． cnki． apps． 2015． 01． 015
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研究简报
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利用 siＲNA 高通量测序技术检测烟草病毒
王 芳，周本国，许大凤，高正良*
设定参数 hash_length 17。组装的重叠群寻找高度 同源序列： 首先，用 blastn 将组装的重叠群比对到 核酸数据库 nt database 中，从比对结果文件中选出 每一条序列的比对结果中 e 值最小的结果，再筛选 出这些结果中比对序列的覆盖度至少达到 90% 且 同源性也至少达到 90% 的结果。组装的重叠群寻 找部分同源序列： 将寻找高度同源序列中没有找到 高度同源性的重叠群，用 blastx 在蛋白质数据库 nr database 中寻找同源序列，所设参数为-e 1e-3，从每 一条重叠群的比对结果中选出 e 值最小的结果。 筛选和已知病毒序列具有同源性的重叠群： 从寻找 高度同源序列和寻找部分同源序列筛选出的结果 中选出和病毒序列同源的重叠群，这些重叠群必须 只和已知病毒同源，若和非病毒序列也具有同等的 同源性，则舍弃。
利用深度测序技术发掘植物病毒资源
a) *: 单向测序; **: 双向测序
352
中国科学: 生命科学
2014 年
第 44 卷
第4期
头上都加上测序引物结合位点 , 在第一轮测序完成 后, 去除第一轮测序的模板链, 用对读测序模块 (paired-end module) 引导互测序 , 读长也从几十碱基 提高到 150 bp. 由于 Solexa 技术在合成中每次只能添 加一个 dNTP, 因此很好地解决了同聚物长度的准确 测量问题.
3
NGS 在植物病毒资源发掘中的应用进展
2 利用 NGS 检测病毒的流程及生物信息学 分析
上文已经介绍了几种常见的高通量测序平台 , 因为其具有高通量的特征 , 一个反应可以获得上百 万条序列信息 , 目前已被广泛地应用于病毒资源的
此后, 各国科学家为解读基因的密码而不懈努力, 这 其 中 最 大 的 突 破 就 是 第 二 代 测 序 技 术 (next generation sequencing, NGS)的推出[7,8]. 与 Sanger 测序技 术相比 , NGS 是一种能一次对几十万到几百万的 DNA 分子进行序列测定的高通量的测序技术 , 这种 高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行 细致全貌地分析成为可能 , 因此又被称为深度测序 (deep sequencing)[9]. 相 比 传 统 的 个 体 基 因 组 测 序 , NGS 使得测序价格日益廉价 , 并且在生物信息学软 件的辅助下 , 可以将大量不同基因片段的信息连接 起来进行基因组组装 , 完成生物的基因组测序 [8]. 这 种新的测序技术革新了植物病毒的诊断方法 , 对于 病毒的流行病学和生态学研究起到了非常重要的推 动作用. 本文围绕 NGS 及其在植物病毒发掘中的应 用进展进行概述.
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植物病理学报ＡＣＴＡＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡ㊀４５(１):８８￣９２(２０１５)收稿日期:２０１４￣０３￣０１ꎻ修回日期:２０１４￣１０￣０９基金项目:质检公益性行业科研专项项目(２０１３１００６８)ꎻ浙江省重中之重林学一级学科开放基金项目(ＫＦ２０１３３０)ꎻ浙江农林大学科研发展基金项目(２０１３ＦＫ０１９)通讯作者:周雪平ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｚｈｏｕ＠ｚｊｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮｄｏｉ:１０.１３９２６/ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.０１３研究简报利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原苏秀１ꎬ２ꎬ徐毅１ꎬ陈莎１ꎬ傅帅１ꎬ钱亚娟１ꎬ张立钦２ꎬ周雪平１∗(１浙江大学生物技术研究所ꎬ杭州３１００５８ꎻ２浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地ꎬ临安３１１３００)ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇＷｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｓｍａｌｌＲＮＡ㊀ＳＵＸｉｕ１ꎬ２ꎬＸＵＹｉ１ꎬＣＨＥＮＳｈａ１ꎬＦＵＳｈｕａｉ１ꎬＱＩＡＮＹａ￣ｊｕａｎ１ꎬＺＨＡＮＧＬｉ￣ｑｉｎ２ꎬＺＨＯＵＸｕｅ￣ｐｉｎｇ１㊀(１ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１００５８ꎬＣｈｉｎａꎻ２ＴｈｅＮｕｒｔｕｒｉｎｇＳｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＳｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉｎ ａｎ３１１３００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＰｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎｓｔｖｉｒｕｓｅｓｔｈｒｏｕｇｈｓｍａｌｌＲＮＡ(ｓＲＮＡ)ｍｅｄｉａｔｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｖｉｒｕｓｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｐｒｏｆｉｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅｓａｎｄｖｉｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｓｕｓｐｅｃｔｅｄｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄＷｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＺｉｊｉｎｇａｎｇＣａｍｐｕｓｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｓＲＮＡｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＡｆｔｅｒａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｏｔａｌｓＲＮＡｓꎬｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔＷ.ｓｉｎｅｎｓｉｓｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＷｉｓｔｅｒｉａｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＷＶＭＶ).Ｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｇｅｎｅｒａｔｅｄ１８.９ｍｉｌｌｉｏｎｓＲＮＡｒｅａｄｓꎬｏｆｗｈｉｃｈ０.３２ｍｉｌｌｉｏｎｗｅｒｅＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓ.Ｕｓｉｎｇｄｅｎｏｖｏａｓｓｅｍｂｌｙꎬ２３.３％ｏｆｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｇｅｎｏｍｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｒｅｐｏｒｔｅｄｐｏｔｙｖｉｒｕｓＷＶＭＶｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆＷＶＭＶｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｓꎬＷＶＭＶｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ(ＣＰ)ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲꎬａｎｄｅｎｓｕｒｅｄｂｙＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＴａｋｅｎｔｏｇｅｔｈｅｒꎬｔｈｅｄａｔａｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｓＲＮＡｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｐｏｗｅｒｆｕｌｇｅｎｅｔｉｃｔｏｏｌｆｏｒｖｉｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｓｍａｌｌＲＮＡꎻＷｉｓｔｅｒｉａｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎻｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ文章编号:０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００８８￣０５㊀㊀ＲＮＡ沉默(ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)是一种在真核生物体内普遍保守的基于核酸序列特异性抑制基因表达的调控机制[１]ꎮ２００９年Ｋｒｅｕｚｅ等[２]发现病毒特异的小ＲＮＡ(ｓｍａｌｌＲＮＡꎬｓＲＮＡ)在序列上是重叠的ꎬ因此推测通过深度测序技术获得的大量ｓＲＮＡ序列能用来组装病毒的基因组并用来鉴定和发现新病毒ꎮ利用ｓＲＮＡ深度测序技术已在作物和昆虫上鉴定发现多种病毒[３㊁４]ꎬ但在木本植物上还未见报道ꎮ㊀㊀紫藤(Ｗｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ)是城市园林绿化美化的主要植物ꎬ在公园㊁校园㊁庭院等地普遍种植ꎮ由紫藤花叶病毒引起的紫藤花叶病在捷克㊁意大利㊁荷兰㊁美国㊁波兰㊁德国等都有发生ꎬ已成为一种世界性的病害ꎮ紫藤花叶病主要表现花叶㊁斑驳㊁黄化㊁脉明等症状ꎬ感病紫藤开花能力明显下降ꎬ严重影响其观赏性和经济价值ꎮ２００６年Ｆａｎ等[５]报道了紫藤脉花叶病毒北京分离物(ＷＶＭＶ￣ＢＪ)的全序列ꎬ并证实ＷＶＭＶ￣ＢＪ是Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ中的一种新病毒ꎮ本文利用深度测序技术对采自浙江的紫藤花叶病病原进行了鉴定ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料来源㊀㊀表现花叶症状的紫藤病叶采自浙江大学紫金㊀㊀１期苏秀ꎬ等:利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原港校区校园内ꎮ感病紫藤叶片表现褪绿㊁花叶㊁斑驳㊁黄化㊁脉明㊁叶片变小㊁卷曲等症状ꎬ并出现小的星状斑ꎬ褪绿部分生长较慢ꎬ致使叶片畸形(图１)ꎮＦｉｇ.１㊀Ｗｉｓｔｅｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓｌｅａｖｅｓｓｈｏｗｉｎｇｃｈｌｏｒｏｔｉｃｓｐｏｔｓꎬｂｌｏｔｃｈｅｓａｎｄｌｅａｆｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ１.２㊀植物总ＲＮＡ提取和ｓＲＮＡ纯化㊀㊀采集的样品用ＴｉａｎｇｅｎｍｉＲｃｕｔｅｍｉＲＮＡ提取分离试剂盒提取总ＲＮＡꎬ操作步骤参照说明书进行ꎬ然后运用醋酸锂和聚乙二醇法(ＬｉＡＣ/ＰＥＧ)分离其中的ｓＲＮＡꎬ经１５％的ＰＡＧＥ分离切割１８~２８ｎｔ的ｓＲＮＡꎮ１.３㊀ｓＲＮＡ的Ｓｏｌｅｘａ深度测序㊀㊀上述ｓＲＮＡ样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序ꎮ测序流程:运用ＴａＫａＲａｓｍａｌｌＲＮＡｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ(ＤＲＲ０６５)将分离的１８~２８ｎｔ的ｓＲＮＡ分别在３ᶄ端和５ᶄ端加上接头ꎻ随机引物反转录获得ｃＤＮＡ第一链ꎻＰＣＲ富集ꎻ产物回收(６％ＮｏｖｅｘＴＢＥＰＡＧＥｇｅｌꎬ１.０ｍｍꎬ１０ｗｅｌｌ)ꎻＴＢＳ３８０(Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ)定量ꎬ按数据比例混合上机ꎻｃＢｏｔ上桥式扩增ꎬ生成ｃｌｕｓｔｅｒｓꎻ运用ＩｌｌｕｍｉａＳｏｌｅｘａ的Ｈｉｓｅｑ２０００测序平台ꎬ进行１ˑ５０ｂｐ测序试验ꎮ１.４㊀Ｓｏｌｅｘａ测序数据的预处理㊀㊀运用生物信息学手段对原始数据进行处理:去接头序列ꎬ去污染序列ꎬ去低质量碱基ꎬ去未插入３ᶄ接头㊁５ᶄ接头的ｒｅａｄｓꎬ获得不含接头序列的ｓＲＮＡ序列ꎬ在此基础上筛选出１８~２８ｎｔ的ｓＲＮＡ序列ꎮ１.５㊀测序数据的序列拼接㊁ＢＬＡＳＴ分析及病毒相关序列的筛查㊀㊀用Ｖｅｌｖｅｔ软件对上述１８~２８ｎｔｓＲＮＡ进行序列拼接ꎬ得到的ｃｏｎｔｉｇｓ用ＢＬＡＳＴ(ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ)进行比对并注释ꎬ经过ＢＬＡＳＴ同源比对筛查到与紫藤脉花叶病毒北京分离物(ＷＶＭＶ￣ＢＪꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＹ６８６８１６)同源ꎮ以ＷＶＭＶ￣ＢＪ为参考基因组ꎬ应用生物信息手段比对得到病毒来源的ｓＲＮＡꎬ并对产生ｓＲＮＡ的热点区进行统计ꎮ１.６㊀ＲＴ￣ＰＣＲ扩增㊁克隆及序列分析㊀㊀提取植物总ＲＮＡꎬ采用ＴａＫａＲａ公司的ＲＮＡＲｅｖｅｒｓｅＰＣＲＫｉｔ(ＡＭＶ)反转录成ｃＤＮＡꎬ以ｃＤ￣ＮＡ为模板ꎬ利用根据拼接到的序列设计的特异性引物和Ｐｈｕｓｉｏｎ超保真ＰＣＲ试剂盒(ＮＥＢ公司)进行ＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ产物纯化后连接到ＰＺｅｒｏＢａｃｋ载体(Ｔｉａｎｇｅｎ)ꎬ并转化Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α感受态细胞ꎬ涂布于含氨苄青霉素的ＬＢ平板上ꎬ培养过夜后挑选单菌落ꎬ用Ｔａｑ酶ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆ꎬ随机挑取２个阳性克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司进行测序ꎬ获得的序列利用ＢＬＡＳＴ进行比较分析ꎮ２㊀结果２.１㊀感病紫藤叶片ｓＲＮＡｓ高通量测序结果㊀㊀感病紫藤叶片经总ＲＮＡ提取ꎬｓＲＮＡ分离㊁纯化和Ｓｏｌｅｘａ测序后得到１８９０２０４６个ｒｅａｄｓꎬ经过Ｓｏｌｅｘａｐｉｐｅｌｉｎｅ加工后ꎬ得到介于１８~２８ｎｔ之间的ｒｅａｄｓ为４６７３４４７个ꎬ占总ｓＲＮＡｒｅａｄｓ数量的２４.７２％ꎮ２.２㊀ＷＶＭＶ来源ｓＲＮＡｓ(ｖｓｉＲＮＡｓ)数据分析㊀㊀以ＷＶＭＶ￣ＢＪ为参考基因组ꎬ将上述经过筛选的４６７３４４７个ｒｅａｄｓ进行本地ＢＬＡＳＴｔ分析ꎬ在不包含重复序列的情况下ꎬ获得与参考基因组完全匹配的ｒｅａｄｓ共９８６８个㊁允许１个错配的ｒｅａｄｓ共４５５１０个㊁允许２个错配的ｒｅａｄｓ共１１３９３２个ꎮ重点分析了允许１个错配的情况ꎮ一共有３１５１２３个ｒｅａｄｓ(包含重复序列)与ＷＶＭＶ￣ＢＪ匹配ꎬ其中２０~２４ｎｔｖｓｉＲＮＡ数量分别为７４１０㊁１９５６９７㊁９９５３６㊁２９５０和１２０８个ꎬ其他长度的ｖｓｉＲＮＡ数９８㊀植物病理学报４５卷量为８４０２个ꎮ有１７９４６８１个来自正义链ꎬ１３５６５５个来自负义链ꎮ㊀㊀通过对不同长度的ｖｓｉＲＮＡ的读数百分比分析(图２)ꎬ可以看出２１ｎｔ和２２ｎｔ大小的ｓＲＮＡ占主要部分ꎮ不同长度ｓＲＮＡ占总数的百分比分别为:２０ｎｔ２.３５％㊁２１ｎｔ６２.１０％㊁２２ｎｔ３１.５９％㊁２３ｎｔ０.９４％㊁２４ｎｔ０.３８％ꎬ其他长度占２.６７％ꎮ由此可见ꎬｖｓｉＲＮＡ以２１ｎｔ和２２ｎｔ大小为主ꎬ可以推测紫藤的ＤＣＬ４和ＤＣＬ２在抗病毒中起了主要的作用ꎮＦｉｇ.２㊀ＳｉｚｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓ㊀㊀将ｖｓｉＲＮＡｓ根据来自ＷＶＭＶ的正义链还是负义链进行分析ꎬ发现来自正义链的(５７％)略高于来自负链的(４３％)ꎮＷＶＭＶ属于单链正义ＲＮＡ病毒ꎬ其基因组正义链含量远高于互补链ꎬ而产生的ｓＲＮＡ比例比较接近ꎬ揭示ＷＶＭＶ复制过程中产生的双链ＲＮＡ中间体可能是ｓＲＮＡ产生的主要来源ꎮ㊀㊀通过对ＷＶＭＶ来源ｓＲＮＡｓ的５ᶄ端起始核苷酸碱基分析(图３)发现ꎬ总的ＷＶＭＶ来源的ｓＲＮＡｓ中ꎬ５ᶄ端起始核苷酸碱基以 Ｕ ㊁ Ｇ ㊁ Ｃ ㊁ Ａ 开头的比例分别是２８.９６％㊁２０.２９％㊁１９.０３％和３１.７０％ꎬ以 Ａ 或 Ｕ 开头的ｓＲＮＡｓ要比以 Ｇ 或 Ｃ 开头的多ꎬ并且在不同长度的ｓＲＮＡｓ中也遵循这样的规律ꎮ这与受侵染拟南芥植株中ＴＭＶ￣Ｃｇ来源的２１ｎｔｓＲＮＡｓ的５ᶄ端起始核苷酸碱基分布一致ꎮ研究证实ꎬ拟南芥中不同的ＡＧＯ蛋白在招募内源ｓＲＮＡ时ꎬ对其５ᶄ端起始核苷酸碱基具有不同的偏好性ꎻ然而ꎬ在紫藤与病毒的互作过程中ꎬＡＧＯ蛋白在招募ｓＲＮＡｓ时是否也遵循同样的规律还需进一步的研究ꎮ㊀㊀利用基于Ｐｅｒｌ语言脚本的程序分析了ＷＶＭＶ来源ｓＲＮＡ在寄主中的热点分布(图４)ꎮ从紫藤叶片分离到的来源于ＷＶＭＶ的ｓＲＮＡ特异序列几乎覆盖了该病毒的全基因组ꎬ但在某些特定的区域ꎬ也称为热点(ｈｏｔｓｐｏｔｓ)区ꎬ各个ｓＲＮＡ序列出现的频率比较集中ꎮ在ＷＶＭＶ基因组的２６００~２７００㊁２９００~３０５０㊁５９００~６０００㊁７８００~７９００以及９２００~９５００位置ｓＲＮＡ出现的频率较高ꎬ尤其是在９３００~９３９０区域ꎬｓＲＮＡ总量达到４２３０个ꎬ并且大部分来自病毒的正义链ꎬ说明该位点可能存在典型的ＲＮＡ双链结构ꎮＦｉｇ.３㊀ＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓ５ᶄｔｅｒｍｉｎａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ０９㊀㊀１期苏秀ꎬ等:利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原Ｆｉｇ.４㊀ＰｏｌａｒｉｔｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓＲＮＡｓＦｉｇ.５㊀ＰｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷＶＭＶｓＲＮＡｃｏｎｔｉｇｓＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｓｏｆｃｏｎｔｉｇｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｒｅｆｅｒｅｎｃｅＷＶＭＶ￣ＢＪｇｅｎｏｍｅ.Ｒｅｄｍｅａｎｓｈｉｇｈｅｓｔｈｏｍｏｌｏｇｙꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｐｉｎｋａｎｄｇｒｅｅｎ.２.３㊀ＷＶＭＶ的ＲＴ￣ＰＣＲ验证㊀㊀用ｖｅｌｖｅｔ软件对１８~２８ｎｔｓＲＮＡ进行序列组装拼接ꎬ共得到８９４条ｃｏｎｔｉｇｓꎬ共有２３条序列与已知的ＷＶＭＶ￣ＢＪ序列匹配ꎬ总长２２５４ｎｔꎬ占ＷＶＭＶ￣ＢＪ基因组全长(９６９５ｎｔ)的２３.３％(图５)ꎮ根据拼接到的序列设计特异引物ꎬ用ＲＴ￣ＰＣＲ方法ꎬ从测序样品的总ＲＮＡ中克隆到９７１ｂｐ的片段ꎬ经测序及同源比对分析ꎬ与ＷＶＭＶ￣ＢＪ病毒序列相似性为８７％ꎬ这段序列编码ＷＶＭＶ的ＣＰ基因(ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＫＪ８３６２８２)ꎮ根据ＩＣＴＶ对马铃薯Ｙ病毒属病毒命名的规定ꎬ此分离物与已知的ＷＶＭＶ￣ＢＪ是同一种病毒ꎮ３㊀讨论㊀㊀传统的植物病毒检测需要对病毒进行纯化和分离ꎬ对样品纯化要求较高ꎬ且需要对病原的生物学特性㊁理化特性㊁基因组特性㊁血清学特性等有预先的了解ꎬ对于未知病原ꎬ这些检测方法的使用就受到了极大限制ꎬ需要较长的研究周期和繁琐的研究过程ꎮ木本植物上的病毒往往含量比较低ꎬ且很难通过摩擦接种的方式进行人工接种ꎬ因此ꎬ传统方法很难检测木本植物病毒ꎬ相关的研究报道很少ꎮ㊀㊀已报道的紫藤花叶病毒北京分离物病原的鉴定是在酶联免疫吸附试验(ＥＬＩＳＡ)基础上ꎬ通过７次逆转录￣聚合酶链反应(ＲＴ￣ＰＣＲ)ꎬ并结合５ᶄＲＡＣＥ等方法得到的[５]ꎮ这些试验方法工作量很大ꎬ耗时长ꎬ较难用于紫藤等木本植物的病毒检测与鉴定ꎮ本文利用小ＲＮＡ深度测序和组装技术ꎬ将分离自浙江的紫藤花叶病病原鉴定为ＷＶＭＶꎮ深度测序技术的发展开辟了大规模快速诊断植物病毒的途径ꎬｓＲＮＡ深度测序已在许多植物的未知病原鉴定中发挥了重要作用ꎮ利用植物体内的１９㊀植物病理学报４５卷ｓＲＮＡ病毒序列ꎬ大大提高了筛查木本植物病毒的效率ꎮ伴随着深度测序成本的降低ꎬｓＲＮＡ深度测序将成为一种经济有效的可用于木本植物病毒鉴定的方法ꎬ值得推广使用ꎮ参考文献[１]㊀ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭ.Ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｓａｎａｄａｐｔｉｖｅｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎｓｔｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００１ꎬ４１１:８３４－８４２.[２]㊀ＫｒｅｕｚｅＪＦꎬＰｅｒｅｚＡꎬＵｎｔｉｖｅｒｏｓＭꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｐｌｅｔｅｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｎｏｖｅｌｖｉｒｕｓｅｓｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｓｍａｌｌＲＮＡｓ:Ａｇｅｎｅｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓꎬｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ３８８(１):１－７.[３]㊀ＷｕＱꎬＬｕｏＹꎬＬｕＲꎬｅｔａｌ.Ｖｉｒｕｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓｍａｌｌｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇＲＮＡｓ[Ｊ].ＰＮＡＳꎬ２０１０ꎬ１０７(４):１６０６－１６１１.[４]㊀ＸｕＹꎬＨｕａｎｇＬꎬＷａｎｇＺꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｍｅｔｏｂｉＰｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｂｙｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ[Ｊ].ＶｉｒｕｓＲｅｓ.ꎬ２０１３ꎬ１４:ｐｉｉ:Ｓ０１６８－１７０２(１３)００３９４－８.[５]㊀ＬｉａｎｇＷＸꎬＳｏｎｇＬＭꎬＴｉａｎＧＺꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＷｉｓｔｅｒｉａｖｅｉｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｓｉｍｉｌａｒｉ￣ｔｉｅｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ａｒｃｈ.Ｖｉｒｏ.ꎬ２００６ꎬ１５１:２３１１－２３１９.责任编辑:于金枝欢迎订阅«植物病理学报»«植物病理学报»是中国植物病理学会主办的全国性学术刊物ꎬ 中国科技核心期刊 ꎮ主要刊登植物病理学各分支未经发表的专题评述㊁研究论文和研究简报等ꎬ以反映中国植物病理学的研究水平和发展方向ꎬ推动学术交流ꎬ促进研究成果的推广和应用ꎮ本刊现已被英国农业与生物技术文摘(ＣＡＢ)㊁联合国粮农组织ＡＧＲＩＳ等收录ꎮ据«中国科技期刊引证报告»(２０１４年版)统计结果ꎬ«植物病理学报»影响因子０.８３２ꎮ荣获首届«中国学术期刊检索与评价数据规范»(ＣＡＪ￣ＣＤ)执行优秀期刊奖㊁２０１２中国国际影响力优秀学术期刊奖和２０１３百种中国杰出学术期刊奖ꎮ本刊为双月刊ꎬ每期定价３０元ꎬ全年６期共１８０元ꎮ邮发代号:８２￣２１４ꎮ欢迎投稿ꎬ欢迎订阅ꎮ编辑部地址:北京市海淀区圆明园西路２号中国农业大学农学楼２４３室邮编:１００１９３电话:(０１０)６２７３２３６４Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｗｂｌｘｂ＠ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ２９。