实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验一 微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色
实验一微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色赵奕玲 121180169一．实验目的1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；3．掌握芽胞染色的步骤要点；4．识别细菌的革兰氏染色和芽胞染色的结果；5．学习无菌操作技术。
二．实验原理一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。
因此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。
三．实验器材载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。
四．实验步骤（一）革兰氏染色1.涂片左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。
若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。
细菌革兰氏染色实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法。
2. 学会使用油镜观察细菌的形态。
3. 了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理革兰氏染色是细菌学中一种重要的染色方法，主要用于区分细菌的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞壁结构上存在显著差异，导致它们在革兰氏染色过程中表现出不同的染色特性。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高，交联度大，乙醇脱色处理后，细胞壁收缩，但结晶紫-碘复合物仍然被留在细胞内，使细菌呈紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，肽聚糖层薄且交联度差，乙醇脱色处理后，细胞壁溶解，结晶紫-碘复合物被脱出，再经碱性品红染液复染，使细菌呈红色。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、碱性品红染液）、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、酒精灯等。
2. 仪器：显微镜、油镜、移液器、移液吸头等。
四、实验步骤1. 涂片：取一环蒸馏水于载玻片中央，用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm²的薄菌膜。
2. 固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料。
3. 初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去染液。
4. 媒染：向涂片滴加碘液，媒染1min后，倾去碘液。
5. 脱色：向涂片滴加95%乙醇，脱色30s，观察菌体颜色变化，直至出现红色。
6. 复染：向涂片滴加碱性品红染液，复染1min后，倾去染液。
7. 洗涤：用蒸馏水冲洗涂片。
8. 染色观察：用油镜观察菌体形态和染色特性。
五、实验结果与分析1. 枯草芽孢杆菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
2. 金黄色葡萄球菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
六、实验讨论革兰氏染色是一种简单、快速、有效的细菌分类方法。
微生物实验报告
微生物实验报告答案【篇一：微生物的革兰氏染色实验报告】=txt> 二、实验目的：1、学习并初步掌握革兰氏染色法；2、认识革兰氏染色的原理；3、稳固显微镜的使用。
三、实验原理：革兰氏染色是 1884 年丹麦病理学家 christain gram 氏创办的，是细菌学中最重要的鉴识染色法。
染色步骤分为四个部分：1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片；2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物；3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色；g- 和 g+ 细胞壁的比较：1、阳性（ g+ ）菌细胞壁特色：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖组成，肽聚糖含量高，构造密切，脂类含量低。
当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保存在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。
2、阴性（ g- ）菌细胞壁特色：细胞壁薄，由两层组成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状构造交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性加强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，所以，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（比如大肠杆菌）。
四、实验器械：1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
2、溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、 95% 乙醇、番红复染液、水。
3、仪器及其余用品：酒精灯、载玻片、显微镜、接种环、试管架、滤纸、滴管。
五、实验步骤：1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦抹洁净，直至液体不再其上缩短为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按惯例方法图片，应涂大，不宜过厚。
2、翻开酒精灯，用火焰固定，不宜烤得太狠，不然菌种呈假阳性。
3 、轻旋结晶紫染液滴管，将其旋出，滴加 1 滴草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位（轻晃使其完整覆盖），染色40s 。
4 、染色达成后倾去染液，水洗至流出水为无色。
5 、将玻片上残留水用滤纸吸去，待其干燥。
细菌形态观察实验报告
一、实验目的1. 掌握显微镜油镜的使用方法。
2. 观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
3. 了解细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢等。
4. 培养对细菌形态结构的识别能力。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有多种形态结构。
通过显微镜观察，可以了解细菌的基本形态和特殊结构，为细菌的分类、鉴定和致病性研究提供依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细菌样本、革兰氏染色液、芽孢染色液、水浸片、盖玻片、载玻片等。
2. 仪器：光学显微镜、酒精灯、载物台、切片刀、镊子等。
四、实验步骤1. 观察细菌样本（1）将细菌样本滴在载玻片上，用盖玻片封口。
（2）在显微镜下观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
2. 革兰氏染色（1）将革兰氏染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其革兰氏分类。
3. 芽孢染色（1）将芽孢染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其芽孢存在与否。
4. 观察细菌特殊结构（1）观察细菌是否有鞭毛、荚膜等特殊结构。
（2）通过水浸片观察细菌的运动。
五、实验结果与分析1. 细菌样本的基本形态结构（1）观察到的细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等基本结构。
（2）部分细菌具有鞭毛、荚膜等特殊结构。
2. 革兰氏染色结果（1）部分细菌呈现革兰氏阳性，细胞壁较厚，不易着色。
（2）部分细菌呈现革兰氏阴性，细胞壁较薄，易着色。
3. 芽孢染色结果（1）部分细菌存在芽孢，呈圆形或椭圆形。
（2）部分细菌无芽孢。
4. 细菌特殊结构观察结果（1）部分细菌具有鞭毛，呈螺旋状。
（2）部分细菌具有荚膜，呈透明状。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了显微镜油镜的使用方法。
2. 观察了细菌的基本形态结构和特殊结构，了解了细菌的生物学特性。
3. 培养了对细菌形态结构的识别能力，为今后的学习和研究奠定了基础。
七、注意事项1. 使用显微镜时，注意调节光圈和焦距，确保观察清晰。
实验四革兰氏染色技术(精)
染液因素
注意试剂的有效期，是否变质，异常时不使用 结晶紫易沉淀 卢戈氏碘液易变质 酒精易挥发
细菌因素
衰老变性的细菌会出现染色性改变
视频：革兰氏染色
（2）斜面培养物涂片： 用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先将 接种环沾取生理盐水 1~2 环臵于载玻片中央， 然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上沾取 葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水 中，轻轻研匀，涂成直径 lcm 左右的均匀薄膜。
2．干燥
涂片最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将
涂面向上，小心地放臵离火焰 20 ㎝处，远 离火焰 上方微加温略烘促使干燥（ 切勿加热过度，以 防 将标本烧枯）。
3．固定
标本干燥后，常用加热固定法。在火焰的最热部分
让玻片有菌膜的面向上，通过酒精灯火焰三次（约 2~3秒钟），固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体 牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染 料的通透性。
5.结果
染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫
色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。 葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以 G+表示；大 肠杆菌染成红色，为革兰阴性，以 G-表示。
菌悬液
涂片
干燥
固定 滴加无 菌水 取菌苔
涂片
四、注意事项
操作因素
脱色：关键步骤 涂片：太厚影响染色，太薄细菌分散不匀 干燥：过热使细菌菌体变形，排列失常
碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水 300ml
先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 300ml 即成。供革兰染色媒染用。
芽孢染色常用方法
芽孢染色是一种常用的微生物实验室技术，用于观察和鉴定细菌的孢子形态和结构。
以下是芽孢染色的常用方法：
1. 热锡烙法（Heat-fixed smear）：将含有芽孢的菌落用细火加热，使其附着在玻璃片上固定。
2. 革兰氏染色法（Gram staining）：首先用洗涤液将玻璃片上的菌落冲洗，接着用紫晶染液染色，再用碘液做固定，用乙醇洗去多余的染色剂，最后用洗涤液冲洗，接着用红素染液染色，最后用洗涤液冲洗干净。
3. 铁血素染色法（Iron-hematoxylin staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用铁血素溶液浸泡一段时间，最后用去离子水冲洗干净。
4. 格拉姆染色法（Spore staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用绿基（Malachite Green）染液浸泡，将玻璃片放入蒸汽中加热，再用水洗去多余染液，最后用红素染液进行反染。
以上是几种常用的芽孢染色方法，具体使用哪种方法取决于实验目的和需求。
微生物学实验3 细菌革兰氏染色和芽孢染色
2022/9/12
Hale Waihona Puke 32022/9/12
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革兰氏染色视频（单击播放）
2022/9/12
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实验三 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一． 实验目的
1. 学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2. 学习细菌芽孢染色的原理和方法。
二． 实验材料
1. 菌种：大肠杆菌
Escherichia coli、
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
2. 染色液：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、 95%乙醇脱色液、番红染液、孔雀绿染液
➢ 芽孢染色：加1~2滴无菌水于小离心管中→ 用接种环挑 取2~3环菌苔于小离心管中，混匀，制成浓的菌悬液→ 加2~3滴孔雀绿小于离心管中，混匀→置于沸水浴中加 热染色15~20min→取底部菌液数环涂片→干燥→固定 →水洗脱色至流出的水无绿色为止→用蕃红染液染色 2~3min →水洗→干燥
➢ 镜检：
3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、 无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
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三． 实验原理：革兰氏染色的原理？芽孢染色原理？
四． 实验步骤
➢ 革兰氏染色：涂片→干燥→固定→结晶紫染液初染 1min →水洗→碘-碘化钾溶液媒染1min →水洗→ 95% 乙醇溶液脱色至流下的乙醇溶液无明显的紫色→立即 水洗→藩红染液复染1～2min →水洗→干燥
➢ 油镜维护：
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五. 实验内容
1. 对所给的两种菌进行混合涂片进行革兰氏染色和油镜 观察（上交一张自己满意的染色片）；
2. 对已进行芽孢染色的枯草芽孢杆菌进行涂片、脱色和 复染，并镜检。
2.细菌的革兰染色法、芽孢染色法
革兰氏染色的机理：
主要由于两类细菌的细胞壁成分{肽聚糖 （不溶于乙醇）和脂类（溶于乙醇）}和结 构{肽聚糖层的交联程度及厚度}不同而造 成的。 革兰氏阳性菌肽聚糖含量高（90％）交联 程度高，肽聚糖层厚（用乙醇不易脱色） 革兰氏阴性菌肽聚糖含量低（10％）交联 程度低，肽聚糖层薄（用乙醇易脱色）。
三、实验器材
1、菌种： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（1
号—培养12h，用于革兰氏染色；2号—培养18h， 用 于 芽 孢 染 色 ） ， 培 养 24 小 时 的 大 肠 杆 菌 （Escherichia coli）用于革兰氏染色。
2、染色液和试剂： 草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘
→水洗→复染（番红2-3min）→水洗→干燥
→镜检
芽孢染色结果
（芽孢呈绿色，营养体呈红色）
注意事项
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使 大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。 2、染色加热过程要及时补充染液，切勿 让涂片干涸。
五、实验作业
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌 的革兰氏染色的反应性。
液、95%酒精、番红染液、5％孔雀绿水溶液、生理 盐水、乙醚-乙醇溶液、香柏油。
3、器材： 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、
擦镜纸、显微镜等。
四、实验方法
革兰氏染色
制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染
（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）
→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→ 观察
革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法因为通过此法染色可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌g主要由于两类细菌的细胞壁成分肽聚糖不溶于乙醇和脂类溶于乙醇和结构肽聚糖层的交联程度及厚度不同而造革兰氏阳性菌肽聚糖含量高90交联程度高肽聚糖层厚用乙醇不易脱色革兰氏阴性菌肽聚糖含量低10交联程度低肽聚糖层薄用乙醇易脱色
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实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色
1.一、目的要求
学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料
菌种：金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕大肠杆菌〔〕
试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液
其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是 1884年由丹麦病理学
家Christain
Gram
创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革染氏染色的根本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保存初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是
标准的革染氏阳性菌。
革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所用的
细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细
菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽
聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保存在细
胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，
类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上
红色。
四、操作步骤
1. 细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
制片：取菌种培养物常规涂片、枯燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖
约1min，水洗。
5.
脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接
用95%乙醇从载
玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
酒精的浓度、用量及
涂片厚度都会影响脱色速度。
脱色是革兰氏染色中最关键的一步。
复染：滴加番红液，染色2min，水洗。
用滤纸吸干，油镜镜检。
五、考前须知
为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活泼生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。
另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和
染色。
六、实验内容
1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革
兰氏染色
对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。
七、实验报告
图示所观察到的菌体细胞的形态与革兰氏染色结果；
2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超
过24小时？
3.
在下表中依次填入革兰氏染色所用染料的名
称，
并填上革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在
每
步染色后菌体所呈的颜色。
在不影响革兰氏反响的前提下，哪一步可被省略？
步骤所用染料
菌体所呈颜
色
革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌1
2
3
4
当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确、结果可靠？
附录：细菌的芽孢染色
一、目的要求
学习芽孢染色的原理和方法
二、实验材料
菌种：枯草芽孢杆菌，肉汁斜面培养24h；
染料：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液
其他：显微镜、载玻片、接种环、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的依据。
由于芽孢壁厚、透性差、不易着色。
当用结晶紫单染色时，菌体呈紫色，芽孢是无色
透明。
芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染
色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，当
用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，进
入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料那么难以透出。
假设再用番红复染，那么菌体呈红
色而芽孢呈绿色。
四、操作步骤
1. 制备菌悬液加1~2滴水于小试管中，用接种环挑取2~3环菌苔于试管中，搅拌均匀，
制成浓的菌悬液。
染色加2~3滴孔雀绿于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15~20min。
涂片固定用接种环取试管底部菌液数环于干净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。
脱色水洗，直至流出的水无绿色为止。
复染用蕃红染液染色2~3min，倾去染液并用滤纸吸干残液。
镜检枯燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊和营养细胞为红色。
注意：所用菌种应掌握菌龄，以大局部细菌已形成芽孢为宜；取菌不宜太少。