细菌芽孢染色
实验22细菌的芽孢染色
• Schaeffer与Fulton氏染色法 ，改良的Schaeffer和
Fulton氏染色法
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芽孢染色的方法和步骤
1.涂片、干燥、固定：待涂片晾干 后在酒精灯火焰上通过2—3次。 2.染色： ①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于 涂片处（染料以铺满涂片为度）， 然后将涂片放在铜板上，用酒精灯 火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算 时间，约维持5-10min。加热过程中 要随时添加染色液，切勿让标本干 涸。（加热时温度不能太高）。 ②水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻 地冲洗，直至流出的水中无染色液 为止。 ③复染：用蕃红液染色1-2min。 3.水洗、晾干或吸干。 4.镜检：
实 验 2-2
细菌的芽孢染色
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细菌的染色和细菌细胞构 造的观察
• 目的要求 • 染色原理 • 实验材料 • 实验程序 • 思考题
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目的要求
• 无菌操作 • 微生物涂片 • 掌握细菌的芽孢染色（枯草杆菌） • 熟炼显微镜使用
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实验材料
• 涂片染色用的细菌培养物
– 芽孢染色（枯草杆菌）24-48h的斜面培养物。
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实 验 2-2
结束
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染色简约流程
• 荚膜染色
– 制片――干燥（空气中晾干或用冷风吹干――复红 染色液染色3-5min――水洗――干燥（晾干）―― 涂苯胺黑（薄层）――风干――镜检――记录
• 芽孢染色
– 涂片－－干燥－－固定――5%孔雀绿水溶液，加 热至染液冒蒸汽，约维持5min（勿干）――冷却 ――水洗――番红液染色1-2min ――水洗－－晾干 或吸干――镜检――记录
实验四细菌的芽孢染色
实验四细菌的芽孢染色细菌的芽孢是指在环境恶劣时，细菌会形成内部有严密壳层保护的休眠结构。
芽孢可以存活在高温、低温、干旱和化学物质等极端环境中，具有极强的耐受性。
因此，了解细菌的芽孢形态和染色技术对于临床医学和微生物学研究具有重要意义。
一、理论知识芽孢染色是一种特殊的细菌染色方法，该方法是通过将细菌在特定的温度和时间条件下培养，诱导细菌形成芽孢。
然后用特殊染剂染色，可以使芽孢呈现出特定的颜色。
这种染色方法可以将细菌分为两类：芽孢形成阳性细菌和芽孢形成阴性细菌。
在芽孢染色实验中，需要用到以下染剂：1. 碘液：可以使细菌和芽孢的细胞质和内浆颜色变成深蓝色。
2. 芽孢绿：能够将芽孢染成绿色。
二、实验步骤1. 准备玻璃片。
取两块无菌的玻璃片，用酒精灼烧消毒，并晾干备用。
2. 细菌培养。
取一株待检测的细菌，接到含有适当营养成分的琼脂平板上。
在适当的温度下，通常是30-37℃，使细菌生长至需要形成芽孢的生长阶段。
3. 热处理。
将培养好的细菌涂在一块玻璃片上，然后将其放置在巴氏杀菌器中，用高温（通常是80℃）处理大约5分钟。
这里的处理过程可以模拟极端环境，诱导细菌形成芽孢。
4. 染色涂片。
将热处理后的细菌涂片放置在滴定瓶中，加入碘液，在室温下静置几分钟。
不要让碘液干燥，否则会影响后续染色效果。
之后，用酒精洗去多余的碘液。
5. 脱色处理。
将染色过的细菌涂片放入酸酒精溶液中，脱色1-2秒钟。
这一步会去除多余的染料，使芽孢显现出绿色。
6. 水洗和固定。
用自来水清洗脱色后的涂片，然后用火焰进行烘干和固定。
三、实验结果与分析芽孢染色的阴性和阳性结构特点如下：芽孢阳性：芽孢位置不定，涂片颜色为绿色。
四、注意事项1. 操作前请认真研究操作步骤并准备好所有必需的实验器材。
2. 涂片需要在室温下进行，但不宜长时间暴露于室外，以免可能的污染干扰实验结果。
3. 涂片需要在染色后及时清洗和固定，否则会有失真或污染的风险。
4. 在过程中要注意无菌操作，以避免其他微生物污染涂片。
细菌芽孢染色法
细菌芽孢染色法一、基本原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
二、器材枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液等。
三、操作步骤方法1、（1）将培育24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
（2）滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。
加热时间从染液冒蒸汽时开头计算约45分钟。
这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。
（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。
（6）待干燥后，置油镜观看，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
方法2、（1）取二支干净的小试管，分别加入0．2ml无菌水，再往一管中加入12接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入12接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成深厚的菌悬液。
（2）在菌悬液中分别加入0．2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热35分钟。
（3）用接种环分别取上述混合液23环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出。
（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。
（5）取12接种环黑色素溶液于涂片处，马上绽开涂薄，自然干燥后，油镜观看，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。
实验四.细菌芽孢染色
实验四.细菌芽孢染色一. 目的要求：目的：掌握细菌芽孢染色方法内容：１．学习并掌握芽孢染色法２．初步了解芽孢杆菌的形态特征二. 基本原理：芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。
因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。
三. 器材1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃）2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液石炭酸复红染液0.05%碱性复红蒸馏水3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等二甲苯.香柏油四. 操作步骤：一）方法1：1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。
2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗.6.制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色，菌体呈红色。
二）方法2：1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。
2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min .4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。
5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
6.加复染液染2-3分钟，水洗。
7.干燥后用油镜观察，芽孢绿色，菌体红色。
五.实验报告：1.绘图：枯草杆菌的芽孢形态，芽孢的着色位置。
实验五细菌芽孢染色法
三、实验器材
• 显微镜，酒精灯，火柴，试管夹，载玻片， 接种环，双层瓶，吸水纸，擦镜纸，蒸馏水； • 孔雀绿染液，沙黄（番红）水溶液； • 巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)， 37℃培养20小时；
四、实验步骤
1 ．制备菌悬液 加2滴水于空试管中，用接种环挑取3环菌苔于试管中，搅拌 均匀，制成浓的菌悬液． 2. 染色 加孔雀绿染液2滴于小试管中，将试管置于沸水浴的烧杯中， 加热染色15~20 min 。 3. 涂片固定 用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜， 然后将涂片通过火焰3 次温热固定。 4. 脱色 水洗．直至流出的水无绿色为止． 5 ．复染 用沙黄水溶液染色2~3min ，倾去染液稍微用水冲去染液并 用滤纸吸干残液． 6 ．镜检 干澡后用油镜观察． 芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色．
涂片固定用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上涂成薄膜然后将涂片通过火焰3次温热固定
实验五
一、实验目的：
细菌芽孢染色法
1.学习并掌握芽孢染色的方法； 2.观：
芽孢具有厚而致密的壁，透性差，不易着 色，而一旦染上颜色，脱色也比较困难。因此芽 孢染色法的基本原则是：采用着色力强的染料， 在加热条件下，延长染色时间以促进标本着色。 然后采用脱色的方法使标本脱色，菌体颜色褪去， 而芽孢上的颜色仍然保留。再用对照的染料进行 复染，使菌体染上复染液的颜色，和芽孢形成鲜 明的对比，容易辨认。
六、实验记录
菌 名 菌体颜色 芽孢颜色 芽孢形状和位置(图示)
巨大芽孢杆菌
芽孢染色
1 ．制备菌悬液 加2滴水于空试管中，用接种环挑取 3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成 浓的菌悬液． 2. 染色 加孔雀绿染液2滴于小试管中，将试 管置于沸水浴的烧杯中，加热染色 15~20 min 。 3. 涂片固定 用接种环挑取试管底部菌液数环于 洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将 涂片通过火焰3 次温热固定。 4. 脱色 水洗．直至流出的水无绿色为止． 5 ．复染 用沙黄水溶液染色2~3min ，倾去染 液稍微用水冲去染液并用滤纸吸干 残液． 6 ．镜检 干澡后用油镜观察． 芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红 色．
芽孢染色原理
芽孢染色原理
芽孢染色原理是一种常用的微生物检测技术，它用于检测和鉴定环境中的芽孢形成菌。
芽孢是某些细菌在环境条件恶劣时形成的一种休眠形态，具有较强的抵抗性。
通过芽孢染色，可以使芽孢形成菌与其他细菌在染色特性上产生差异。
芽孢染色的原理是利用芽孢与普通细菌在某些染色方法下的染色差异。
最常用的芽孢染色方法是格莱姆染色法，其中主要的染色剂是马来酸、苏木紫和碘液。
格莱姆染色法的原理是由于芽孢的外壁较硬，容易保持紫色的苏木紫染色，而无色的马来酸则可以与芽孢内部的钙结合生成蓝色沉淀，这样芽孢就呈现出紫色的外壁和蓝色的内部。
在实际操作中，首先需要将待检样品进行培养和孵育，使芽孢形成。
然后将培养物涂布在玻璃片上，用热菌液固定，再用热针将固定的菌液涂成圆形。
接下来，将玻璃片放到格莱姆染色试剂中，经过一系列的染色步骤，最终得到染色好的芽孢形成菌。
通过观察染色后的芽孢形成菌，在显微镜下可以看到紫色的外壁和蓝色的内部。
而其他普通细菌则只呈现出一种颜色，如红色或粉色。
这样，就可以通过芽孢染色的特异性染色结果来区分芽孢形成菌和其他细菌。
总之，芽孢染色原理是通过染色差异来鉴定芽孢形成菌，利用芽孢外壁较硬、易于保持紫色苏木紫染色和能与马来酸生成蓝色沉淀的特性，达到区分芽孢形成菌和其他细菌的目的。
实验五 细菌芽孢染色
实验五——细菌芽孢染色山东大学生命科学学院09级四班张行润200900140177 摘要细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。
所有的芽孢染色法都基于一个原则：除了用着色强的染料外，还须要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
关键词芽孢（gemma of a fungus）芽孢染色法（Spore staining）复染（counterstain）前言细菌的芽孢的某些细菌的特殊结构。
芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或椭圆形的休眠体，它对不良环境具有很强的抗性。
在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。
芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴定细菌的重要依据。
在一般实验室中通常用芽孢染色法来观察其形态。
此外，由于芽孢具有很强的抗性，因此在生产实践中都以是否有杀死抗性最强的芽孢来评定高温灭菌及某些化学杀菌剂的效果。
一、实验目的1.学习并掌握芽孢染色法2.了解芽孢杆菌的形态特征3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，液被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。
与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。
利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。
实验5 细菌的芽孢染色法
改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
❖制备菌悬液 ❖染色 ❖涂片固定 ❖脱色 ❖复染 ❖镜检
1、滴生理盐水 生理盐水
滴半滴生理 盐水在载玻 片中央
制片
2、涂片 挑取少量菌苔
3、干燥 室温自然晾干
与生理盐水混匀 均匀涂布
或电吹风吹干
染色
1、滴孔雀绿染液 5%孔雀绿染液
实验五、细菌的芽孢染色法
实验的目的要求
❖学习并掌握芽孢染色法 ❖进一步了解芽孢杆菌的形态特征
细菌芽孢的基本构造
孢外壁 芽孢衣 皮层 芽孢壁 芽孢质膜 芽孢质 芽孢核区
芽胞具有多层厚而 致密的胞膜，由内向 外依次为核心、内膜、 芽胞壁、皮质、外膜、 芽胞壳和芽胞外衣 .
细菌芽孢的基本特性
❖形成芽孢需要一定的外界条件，这些条件 因菌种而异。炭疽芽孢杆菌在有氧(O2)条 件下才能形成芽孢，而破伤风芽孢杆菌则 在无氧条件下形成芽孢。通常细菌在营养 不足时形成芽胞，但苏云金芽孢杆菌是例 外。
2min
不要直接冲菌膜
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、干燥 室温自然晾干
或电吹风吹干
镜检
2、镜检 显微镜操作
油镜使用
或吸水纸吸干
制备菌悬液
1、滴生理盐水 生理盐水
2、制备菌悬液 挑取2-3环菌苔
在EP管中滴2 滴生理盐水
与生理盐水混匀 均匀
1、滴加孔雀绿染液 5%孔雀绿染液
染色
2、加热染色
在EP管中滴2-3 滴孔雀绿染液
❖细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽 孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大 等特征是鉴定细菌的依据之一。
细菌芽孢染色原理
❖细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色， 若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不 着色(芽孢呈无色透明状)。
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姓名班级13级生命基地班学号同组者：
科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
【实验题目】
细菌芽孢染色
【实验目的】
1.学习并掌握芽孢染色法
2.了解芽孢的形态特征
【实验器材】
1、菌种：
枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2、溶液和试剂：
a) 5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水
b) 香柏油、二甲苯
3、仪器及其它用品：
普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等
【实验原理】
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。
在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。
是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。
与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。
利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。
然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
【实验内容及步骤】
2、具体步骤：
1)洗片、干燥
取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。
干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。
方便以后水洗染料，避免洗去细菌。
2)涂片
取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）
3)加热固定
姓名班级13级生命基地班学号同组者：
科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；
4)染色
向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌位置，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5min，加热时注意补充染液，切勿涂片干涸。
5)脱色
冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水为无色。
6)复染
用0.5%的番红水溶液复染2min。
7)水洗
用缓流自来水冲洗至流出水为无色。
8)干燥镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。
【结果分析】
1、染色结果
镜检观察，芽孢呈绿色，菌体为红色。
枯草芽孢杆菌菌体形态为短杆状，末端钝圆，单生或形成短链，芽孢呈椭圆状，位于菌体中央或稍偏，含芽孢菌体不膨大（见图1）。
梭装芽孢杆菌芽孢呈圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于菌体中央或极端，使菌体膨大呈梭状（见图2）。
芽孢染色结果
菌种名称菌体颜色芽孢颜色芽孢形状芽孢囊形状芽孢着生位置
枯草芽孢杆菌红色绿色椭圆或柱状圆形不膨大中央或稍偏
梭状芽胞杆菌红色绿色圆形或卵圆
形膨大呈梭状中央、极端或次
极端
姓名班级13级生命基地班学号同组者：科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
图1：枯草芽孢杆菌
图2：梭状芽胞杆菌
姓名班级13级生命基地班学号同组者：
科目微生物学实验题目细菌芽胞染色组别3
2、实验结果分析
在观察枯草芽孢杆菌芽孢时，发现有些部位孔雀绿水溶液染色较浅，影响观察。
以后实验中应注意孔雀绿水溶液加入的量，及加热时间，防止染色程度不够，同时
也应避免染色程度过深，多余染液不易完全洗去,影响观察。
在今后的芽孢染色实验中应注意以下几点：
1、选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂；
2、加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破
裂
3、加热染色时控制好时间，加热不够则芽孢难以着色；时间过长会使染色过深，
不易洗脱
4、脱色时必须等待玻片冷却以后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。
【思考与讨论】
1、为什么芽孢染色需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽胞？
细菌的芽孢壁较厚,对染料的通透性差,不易着色，在加热的过程中，芽孢的渗透性会发生变化，染液能顺利渗透进入芽孢，使染色效果更佳，所以芽孢染色需要加热。
不能用简单染色法进行芽孢染色。
因为简单染色法没办法给芽孢着色，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。
2、若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。
A)可能该细菌培养时间过长，已到达生长的中后期，随着环境中营养物质的消耗，以及细菌代谢产物的积累，使得环境越来越不利于生长，因此产生大量的芽孢以度过不良环境。
B)可能是在用孔雀绿染色后，水洗时没有洗净，细胞还是孔雀绿的颜色。
C)可能是在用番红水复染时，染色时间过短，没有染色成功。
3、用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？
脱色必须等玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。