骨髓细胞学检查一

碱性磷酸酶染色（NAP）
1. 目的： 掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的 原理、方法、注意事项和临床意义。 2. 原理： 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能 水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的 有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的 有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等。
（一）固定

固定有物理法与化学法，
前者为干燥和火焰固定， 后者最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。
（二）显示

偶氮偶联法：这类方法多利用人工合成的酶底物，在
酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮 偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存
在。

联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于 过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色 沉淀。

Hale Waihona Puke （三）细胞化学定量

粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴 性和各种程度的阳性。

百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将前述的等级估量与百分率相结 合（计算方法见碱性磷酸酶染色），它既反映了细胞阳性率的 高低，又反映了细胞受色的强弱。
第三节 骨髓细胞学检查 一、常用血细胞化学染色
昆明医科大学第二附属医院 徐益恒
血细胞化学染色
是以细胞形态学为基础， 运用生物化学或化学技术 对血细胞内化学成分、代谢产物等进行定性/定位 /半定量检查的方法 用于某些血液的诊断、疗效观察及预后判断。
本节课主要任务

机体铁储备状况：骨髓铁染色
感染性及白血病鉴别诊断：中性粒细胞碱性
铁染色（Iron stain）
细胞外铁的划分标准: (-)：无颗粒。 (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者 称为铁小珠)。 (++)：有较多的铁颗粒或小珠。 (+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。 (++++)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。 铁粒幼细胞划分： Ⅰ型：幼红细胞内含1～2个小铁颗粒。 Ⅱ型：幼红细胞内含3～5个小铁颗粒。 Ⅲ型：幼红细胞内含6～10个小铁颗粒，或1-4个大铁颗粒。 Ⅳ型：幼红细胞内含10个以上小铁颗粒，或5个以上大铁颗粒。 环形铁粒幼细胞：环形铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞的标准为含铁粒在 6 个 以上,其中 2/3 以上的铁粒围核成完全或不完全性环形 ( 围核 1/2 以上的区域有铁粒环绕 ) 。
铁染色（Iron stain）
3.方法步骤 1) 干燥涂片用甲醇固定10min，待干。 2) 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。 3) 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10～15min。 4) 流水冲洗，待干，镜检。 5) 结果判断 (1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 (2) 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附 近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。 (3) 细胞内铁 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞质中 含有蓝色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内 铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒 幼细胞分为四型。
碱性磷酸酶染色（NAP）
4. 注意事项： 1）磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适 应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的 关键。 2）基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥 后，才开始配制基质液。 3）若无2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥缓冲液 (pH9.2)或0.2mol/L Tris缓冲液(pH9.2)代替。
过氧化物酶染色（POX)
5. 临床意义 POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML) 、急性单核细胞白血 病(acute monocytic leukemia, AMOL) 、 急性淋巴 细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL) 的 重要细胞化学染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性 反应, 阳性颗粒一般较多， 较粗大，常呈局限性分 布；ALL时白血病细胞呈阴性反应；AMOL时白血病细 胞呈阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小， 呈弥散分布。
铁染色（Iron stain）
5.临床意义： 1）鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁 显著减少或消失，铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒 细小色浅，且以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见，Ⅲ型以上不 见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检 查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA， 如HA、MA、AA等病人的细胞外铁通常增高，内铁亦增 高，以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，罕见Ⅳ型。 因此，有助于鉴别IDA与非IDA。 2）用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形 铁粒幼细胞，多见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。 3）用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁 粒幼细胞＞15%。
这些方法学在白血病的鉴别诊断上很重 要，须对其染色方法和临床意义加以充 分地理解。下面介绍几种常用的细胞化 学染色方法。

过氧化物酶染色（POX)
1. 目的: 了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。
2. 原理: （四甲基联苯胺法） 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶 (peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H2O2，使之氧化为 四甲基联苯胺蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合， 再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。 若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则自我脱氢氧化成棕色 的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。
磷酸酶染色（NAP）

白血病FAB分型：过氧化物酶染色，氯乙酸ASD萘酚酯酶染色，过碘酸-雪夫反应， α-丁酸萘酚酯 酶染色 +氟化钠抑制试验
铁染色（Iron stain）
1.目的 掌握骨髓铁染色(bone marrow iron stain) 的原理、方 法、注意事项及临床意义。
2. 原理 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁 经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生 普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的 部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱可了解 骨髓中铁的含量。 4 Fe3+ ＋ 3 K4［Fe（CN）6］→ Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12 K+ （含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）
碱性磷酸酶染色（NAP）
3. 方法步骤： 1) 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲 洗30～60s，待干。 2) 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～ 15min。 3) 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲 洗，待干，镜检。 4) 结果判断 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。 判断标准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5) 计算阳性率和积分值。
过氧化物酶染色（POX)
阳性—胞浆中见兰黑色或深棕色沉淀。 阴性—胞浆中未见兰黑色或深棕色沉淀。 （四）结果评判 弱阳性 — 胞浆中见少量弥散细小阳性颗粒。 阳 性 — 胞浆中见较多粗大阳性颗粒。 强阳性 — 胞浆中见大量粗大阳性颗粒。 （五）正常阳性细胞 中性粒细胞 强阳性 嗜酸粒细胞 强阳性 单 核 细胞 弱阳性或阳性（弥散状）
白血病细胞化学染色概述

细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学
或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定 性及半定量分析的方法。

用于研究血细胞生理、病理和化学结构； 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、 预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。

白血病细胞化学染色概述

血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和
环形铁粒幼红细胞
铁染色（Iron stain）
4.注意事项： 1）玻片需经去铁处理 将新玻片用清洁液浸泡24h， 取出后反复水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸 泡在5%盐酸中24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出 烤干后备用。 2）骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒， 取材不佳时，往往影响结果。 3）酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。
碱性磷酸酶染色（NAP）
阳性 — 胞浆中可见兰色(红色)沉淀物。 阴性 — 胞浆中未见兰色(红色)沉淀物。 （四）结果评判 （—）0分：胞浆无沉淀物（无色） （—）1分：胞浆见浅灰色，无颗粒或有少量细小颗粒但小于胞浆1/4面积。 （—）2分：胞浆见浅棕黑色，有较粗黑色颗粒但小于胞浆1/2面积。 （—）3分：胞浆见粗大黑色颗粒，可达胞浆面积3/4以上。 （—）4分：胞浆见粗大深黑色颗粒，达胞浆全部面积甚至可掩盖于胞核上。 （五）正常阳性细胞 在血细胞中除成熟中性粒细胞阳性外，其他细胞基本呈阴性。 中性粒细胞NAP活力正常范围2% - 56% 正常积分4 - 80分/100个中性粒细胞
碱性磷酸酶染色（NAP）
5. 临床意义： 临床上主要用于鉴别： 1）慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)(无继发性感染者)时，NAP积分一般明显下降，积分 常＜13分，甚至为零分；类白血病反应(leukemoid reaction)时则显著增高，积分常＞200分。 2）阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)常降低；再生障碍性贫血常增高， 病情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 3）急性白血病的细胞类型： ALL增高，AML下降。