第二章2 鉴别 薄层色谱法

第二章 中药制剂的鉴别 第二节 理化鉴别 三、色谱法 --------------薄层色谱法 --------------薄层色谱法
薄层色谱法在中药制剂的定性鉴别中得到 薄层色谱法在中药制剂的定性鉴别中得到 广泛的应用，这主要是由于其具有分离分析 分离分析双 广泛的应用，这主要是由于其具有分离分析双 重功能， 重功能，大大提高了鉴别工作的灵敏度和专属 成为中药鉴别的重要方法和鲜明特色。 性，成为中药鉴别的重要方法和鲜明特色。薄 层色谱法还可用于药品的杂质检查 含量测定。 杂质检查和 层色谱法还可用于药品的杂质检查和含量测定。 中国药典大多数品种采用硅胶薄层色谱法， 硅胶薄层色谱法 中国药典大多数品种采用硅胶薄层色谱法， 少数使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝色谱法。 少数使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝色谱法。
6.记录 6.记录 薄层色谱图象可采用摄像 设备拍照， 设备拍照，以光学照片或电子 图象的形式保存。 图象的形式保存。也可以用扫 描仪记录相应的色谱图。 描仪记录相应的色谱图。 7.结果判断 7.结果判断 供试品色谱中， 供试品色谱中，在与对照 品、对照药材或对照提取物色 谱的相应的位置上， 谱的相应的位置上，显相同颜 色或荧光的斑点， 色或荧光的斑点，则判断为符 合定。 合定。
2.制备薄层板（略） 2.制备薄层板（ 制备薄层板 3.点样 定量点样
.
溶剂前沿
（展开距离） 展开距离）
8~15cm
原点起 始线
≥5mm
≥8mm
1~1.5cm
(点样位置 点样位置) 点样位置
展开剂 液面
4.展开（略） 展开（ 5.显色与检视 5.显色与检视 颜色较深的成分可直接在日光下检视其斑点 可直接在日光下检视其斑点。 颜色较深的成分可直接在日光下检视其斑点。 无色或浅色的成分多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色 多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色， 无色或浅色的成分多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色， 或再加热使之显色。 或再加热使之显色。 有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在紫外灯 有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在紫外灯 365nm）下观察荧光色谱。 （365nm）下观察荧光色谱。 有的成分可用试剂的蒸气 可用试剂的蒸气（ 碘蒸气、氨蒸气）熏蒸显色。 有的成分可用试剂的蒸气（如碘蒸气、氨蒸气）熏蒸显色。 无色有紫外吸收且不产生荧光的成分可用荧光淬灭法显色 可用荧光淬灭法显色。 无色有紫外吸收且不产生荧光的成分可用荧光淬灭法显色。 即在含有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254 ），在紫外光灯 GF254板 即在含有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在紫外光灯 （254nm）下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。 254nm）下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。
1.薄层色谱法定性的基础 基于相同物质在同一色谱条件下， 基于 相同物质在同一色谱条件下，表现出相 相同物质在同一色谱条件下 同的色谱行为这一基本规律， 同的色谱行为 这一基本规律，在同一块薄层板上 这一基本规律 点加供试品和对照物，在相同条件下展开， 点加供试品和对照物 ， 在相同条件下展开 ， 显色 检出色谱斑点后， 检出色谱斑点后 ， 将所得供试品与对照物的色谱 图进行对比分析，从而对药品进行定性鉴别。 图进行对比分析，从而对药品进行定性鉴别。
2.特点 2.特点 简便、快速、易普及、具有分离和分析双重功能， 简便、快速、易普及、具有分离和分析双重功能，且采 分离和分析双重功能 用共薄层对照分析法， 专属性亦较强。 用共薄层对照分析法，故专属性亦较强。 亦较强 三、系统适用性试验(05版药典新增) 系统适用性试验(05版药典新增) (05版药典新增 1.检测灵敏度 1.检测灵敏度 主要用于限量检查. 主要用于限量检查.采用供试品溶液和对照品溶液与稀释 限量检查 若干倍（10倍）的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一 若干倍（10倍 的对照品溶液在规定的色谱条件下， 块薄层板上点样、展开、检视，后者应显示清晰的斑点。 块薄层板上点样、展开、检视，后者应显示清晰的斑点。 2.分离度 2.分离度 用于鉴别时 对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点， 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点， 鉴别 应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时 应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时， 清晰分离的斑点 限量检查和含量测定 要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，除另有规定外， 要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，除另有规定外， 分离度应大于1.0。 分离度应大于1.0。 1.0
四、对照物的选择 对照品和对照药材同时对照( 双对照” 3.对照品和对照药材同时对照(“双对照”) 为了准确检验制剂投料的真实性， 为了准确检验制剂投料的真实性，有时仅用对照 品无法鉴别出来，这时可增加原药材作为对照药材。 品无法鉴别出来，这时可增加原药材作为对照药材。 例如含有黄连 黄柏的制剂， 含有黄连、 例如含有黄连、黄柏的制剂，单用小檗碱对照品 来鉴别是不足足以说明的， 来鉴别是不足足以说明的，此时应增加黄连作为对照 药材进行检视。 药材进行检视。 要求样品色谱图中的主要斑点应与对照品和对照 药材色谱图中的有关斑点相一致，从而大大提高了薄 药材色谱图中的有关斑点相一致， 专属性和整体性， 层色谱鉴别法的专属性和整体性 层色谱鉴别法的专属性和整体性，可有效地检出药品 是否使用了假冒药材。 是否使用了假冒药材。
4.阴阳对照 由于中药制剂中许多化学成分和有效成分不明确 化学成分和有效成分不明确， 由于中药制剂中许多化学成分和有效成分不明确，或有 效成分虽已明确但又无对照品 此时可采用阴阳对照 无对照品， 阴阳对照法进行 效成分虽已明确但又无对照品，此时可采用阴阳对照法进行 鉴别。 鉴别。 阳性对照液制备：把制剂中要鉴别的某味原药材， 阳性对照液制备：把制剂中要鉴别的某味原药材，按制 剂的制法处理后，以制剂相同的比例、条件、方法提取， 剂的制法处理后，以制剂相同的比例、条件、方法提取，制 成该味药的阳性对照液。 成该味药的阳性对照液。 阴性对照液制备：从制剂处方中除去要鉴别的该味药材 除去要鉴别的该味药材， 阴性对照液制备 ：从制剂处方中除去要鉴别的该味药材， 剩下各味药则按制剂方法出理后，以制剂相同的比例、条件、 剩下各味药则按制剂方法出理后，以制剂相同的比例、条件、 方法提取，制成该味药的阴性对照液。 方法提取，制成该味药的阴性对照液。 通过样品和对照品的阳性对照液、 通过样品和对照品的阳性对照液、 阴性对照液在同一条 件下的色谱图可判断样品中有无该味药材 有无该味药材， 件下的色谱图可判断样品中有无该味药材，并可观察阴性对 照液中有无干扰来确定该鉴别的专属性。 有无干扰来确定该鉴别的专属性 照液中有无干扰来确定该鉴别的专属性。 实例： 实例：枳实导滞丸中黄连的薄层鉴别 P19
A B
W1 d1W2d2来自3.重复性 主要用于含量测定 含量测定. 主要用于含量测定.即同一供试品溶液在同一块薄层板上 相对标准偏差(RSD) 平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差(RSD)应 平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差(RSD)应 不大于3 需显色后测量的相对标准偏差应不大于5 不大于3.0%；需显色后测量的相对标准偏差应不大于5.0%。 四、对照物的选择 对照物分为对照品（ 对照物分为对照品 （ 主要为有效成分和特征性成分的单 也包括对照提取物）和对照药材两种。 体，也包括对照提取物）和对照药材两种。 对照物的设置有以下四种方式 有以下四种方式： 对照物的设置有以下四种方式： 对照品对照： 1.对照品对照： 用已知中药制剂某一种有效成分或特征性成分对照品制 成对照液，与样品在同一条件下层析， 成对照液，与样品在同一条件下层析，比较相同位置有无同一 颜色（或荧光）的斑点，来检测是否含有某原料药材。 颜色（或荧光）的斑点，来检测是否含有某原料药材。可设置 一种或数种对照品 对照品。 一种或数种对照品。 对照药材对照： 2.对照药材对照：缺乏对照品的情况下使用
4.温度的影响 在其他条件相同时， 在其他条件相同时 ， 展开时的温差较大会导致斑点扩散及 被分离物质的R 值和物质的相互分离度不一致， 被分离物质的 Rf 值和物质的相互分离度不一致 ， 影响薄层色谱 的重现性。 的重现性。 六、仪器与材料（略） 仪器与材料（ 七、操作步骤 一般操作步骤为： 制备薄层板（制板） 一般操作步骤为：供试液的制备→制备薄层板（制板）→点 样→展开→显色与检视 展开→ 1.供试液制备：包括提取和净化（除去杂质，消除干扰） 供试液制备：包括提取和净化（除去杂质，消除干扰） 常用的预处理方法有：溶剂提取法（包括冷浸、回流、 常用的预处理方法有 ： 溶剂提取法 （ 包括冷浸 、 回流 、 超声 提取） 萃取法，升华法，蒸馏法小型层析柱的柱色谱法、 提取 ） ； 萃取法 ， 升华法 ， 蒸馏法小型层析柱的柱色谱法 、 离 子交换法等。 子交换法等。
2.薄层色谱的点样 点样是关键的一步，既关系到能否得到可重现的薄层色谱， 点样是关键的一步 ， 既关系到能否得到可重现的薄层色谱 ， 也关系到定量结果的准确与否， 也关系到定量结果的准确与否 ， 不良的点样是测定误差的主要 来源。 来源。 3.吸附剂的活性与相对湿度的影响 硅胶为亲水性吸附剂，其含水量越高，吸附活性越弱， 硅胶为亲水性吸附剂 ， 其含水量越高 ， 吸附活性越弱 ， 自 点样开始直展开前，薄层板都是暴露在空气中， 点样开始直展开前 ， 薄层板都是暴露在空气中 ， 其活性取决于 空气的相对湿度，薄层板在不同的相对湿度条件下， 空气的相对湿度 ，薄层板在不同的相对湿度条件下 ， 其吸附活 性亦不同，致使薄层色谱重现性较差。 性亦不同，致使薄层色谱重现性较差。 实验室可用适当浓度的硫酸溶液来控制展开时的相对湿度。 硫酸溶液来控制展开时的相对湿度 实验室可用适当浓度的 硫酸溶液 来控制展开时的相对湿度 。 硫酸溶液的浓度越高其吸湿性越大， 硫酸溶液的浓度越高其吸湿性越大 ， 使得展开室中的相对湿度 越小；反之，则越大。 越小；反之，则越大。
分离度（ 分离度（R）的计算公式为： 的计算公式为： R=2 R=2(d2-d1)/W1+W2 为相邻两峰中后一峰与原点的距离； 式中 d1为相邻两峰中后一峰与原点的距离； 为相邻两峰中前一峰与原点的距离； d2为相邻两峰中前一峰与原点的距离； 为相邻两峰各自的峰宽。 W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。