il-21编码基因的克隆及其在大肠杆菌中表达
基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建
基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建张飞飞;石牡丹;尚广东【摘要】[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率.[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能.[结果]敲除了编码降解外源DNA的Ⅰ型限制性内切酶的ksdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BI21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株.[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)020【总页数】4页(P29-31,72)【关键词】重组工程;基因敲除;双链断裂修复;大肠杆菌BL21(DE3)【作者】张飞飞;石牡丹;尚广东【作者单位】徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S188酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。
野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。
高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一。
突变体库也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。
常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法(如 DNA shuffling［1］和易错 PCR［2］)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源蛋白表达宿主菌。
escherichia coli k12过表达 -回复
escherichia coli k12过表达-回复如何在大肠杆菌K12中过表达目标蛋白。
引言：大肠杆菌(K12)是常见的实验室模型菌株之一，广泛应用于分子生物学和生物工程研究领域。
过表达外源蛋白是研究蛋白功能和生物过程的重要手段之一。
本文将介绍如何在大肠杆菌K12中进行过表达，并提供详细的步骤和相关技术。
第一部分：构建过表达载体1. 选择合适的表达载体：选择适合大肠杆菌K12的表达载体，常见的包括pET系列和pBAD系列。
根据需求选择合适的启动子、选择抗生素耐药基因等。
2. 克隆目标基因：使用标准的分子克隆技术，将目标基因插入表达载体的多克隆位点(MCS)上，确保正确的定向和插入。
3. 验证重组载体：通过限制性内切酶酶切和测序等方法，验证克隆成功的重组载体，确保目标基因的正确插入。
第二部分：转化大肠杆菌1. 准备化学竞争性转化试剂(如CaCl2)：将大肠杆菌K12 试管预培养在含有适当抗生素的LB培养基中，30C静置过夜，或在37C上摇培养2-4小时。
2. 收获菌液：从预培养的菌液中取适量菌液，通过离心将细胞沉淀，并用LB培养基中的胞质液重悬滞液沉淀。
3. 转化：将化学转化试剂添加到胞质液中，进行热突变，使得大肠杆菌细胞获得质粒的能力。
然后将转化液在37C孵育60-90分钟，再在冰上孵育10分钟。
4. 表达抗生素抗性：将转化后的菌液均匀涂布在含有抗生素的培养基上，并在37C下培养过夜，以筛选抗生素抗性阳性菌落。
第三部分：过表达蛋白1. 前处理：将含有抗生素阳性菌落的菌液接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养至适当的菌液浓度(通常为OD600约为0.5-0.8)。
2. 诱导表达：加入适当浓度的诱导剂，如IPTG，诱导目标基因的表达。
培养条件如温度、培养时间、诱导剂浓度等根据实验需求进行调整。
3. 培养和收获蛋白：在适当的温度和时间下继续培养大肠杆菌，通常在30C或37C下进行培养。
通过离心将细胞沉淀并收取，然后通过超新星破碎细胞壁，释放目标蛋白。
人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
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第 ２ 卷第 １ １ 期
２０ ０ ８年 １月
烟 台大 学学报 （ 自然 科学 与工 程版 ）
Ｊｕｎｌ ｆ ａｔｉ ｎｖｒｉ Ｎ ｔ ａ Ｓｉ ｃ ｎ ｎｉｅｒ ｇＥ ｉｏ ） ｏｒａ ｏ ｎａ Ｕ ｉ ｓ ｙ（ ａ ｒｌ ｃ ｎｅａｄＥ ｇ ｅｉ ｄｔ ｎ Ｙ ｅ ｔ ｕ ｅ ｎ ｎ ｉ
维普资讯
第１ 期
杜广 营 ： 人肠 激酶 轻链 基 因的克 隆及 其在 大肠 杆菌 中的表达
４ １
Ｒ 公 司 ； ｉ Ｎ Ａ Ａ ａｏｅ 购 自 ＱＡ Ｅ 公 司 ； ａ Ｎ — Ｔ ｇｒｓ： ＩＧ Ｎ
Ｄ Ａ Ｍａｋ ｒ，０ ｐ Ｌ ｄ ｅ ｒｅ ： 京 鼎 国 生 Ｎ ｒｅｓ １０ ｂ ａ ｄ ｒＭａｋ ｒ北
的肠 激酶轻 链 （ ｎｅｏｉ ｓ ｇｔ ｈｉ，Ｅ ． ． Ｅ ｔｒ ｎ ｅｌ ｈ ｃａｎ Ｋ ） 已 ｋａ ｉ 经成 功采用 原核 或真 核 的表 达 系统得 到 了有 生 物 活性 的重组 牛 肠 激 酶 轻链 Ｊ另 外还 有对 小 鼠 ．
体； 大肠杆菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） Ｌ １ Ｄ ３ 为本 实验室保存菌种．
则具 有全 酶 完 整 的催 化 活 性 ． 年 来 ， 内 外 近 国
１ 材 料 与 方 法
１ １ 菌株 、 ． 质粒 和试 剂仪 器
关 于重组肠 激 酶研 究 的报 道 已经 很 多 ， 部 分 是 大
克 隆表达 只有 ２ ５个 氨基酸 残基 的具 有全酶 活性 ３
表达 载体 采用张 智 清教 授 构 建 的 ｐ Ｖ ２ Ｂ ２０载
ｌｇ ｔｃ ａｎ，ｈ ｉｈ ｈ ｉ ＥＫ。 ， ） 除用于 融合 蛋 白切 割纯 化外
．
合表达的方式． 融合蛋 白中的融合片段会影响 目 的蛋 白的生物 功 能． 期采 用 化 学 裂解 法 除 去 融 早
大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达
中国农业科技导报，2011，13(2):53－58Journal of Agricultural Science and Technology收稿日期:2010-11-29;接受日期:2011-01-26基金项目:国际科技合作项目(2008DFA32080)资助。
作者简介:董世雷，硕士研究生，主要从事微生物与分子生物学的研究。
E-mail :dsl166@126．com 。
通讯作者:王欣，研究员，博士，主要从事微生物生态与免疫方面的研究。
Tel :0571-86415126;E-mail :xxww101@sina．com 大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT 的克隆及表达董世雷1，2，刘伟2，朱立颖2，王学琴3，于宏伟4，王欣2(1．浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004;2．浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，杭州310021;3．内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特010051;4．马歇尔大学微生物学与免疫学院，亨廷顿25755，美国)摘要:OmpT (Outer-membrane proteases T )是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。
利用大肠杆菌OmpT 降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽，可以为开发抗OmpT 蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。
根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT 的基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应(PCR )方法，从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954bp 的序列，测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99．99%。
将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a 上构建重组表达质粒pET28a-OmpT 。
经IPTG 诱导后，在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36kDa 且具有生物活性的OmpT 蛋白。
生长曲线试验显示，抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT 的大肠杆菌生长没有影响，而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。
结核杆菌分泌蛋白katG基因的克隆、表达及其诊断价值
结核杆菌分泌蛋白katG基因的克隆、表达及其诊断价值吴雪琼;张俊仙;张翠英;张妍;王安全;金关甫【期刊名称】《广东医学》【年(卷),期】2004(025)001【摘要】目的获得重组katG(简称rkatG)蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值.方法应用基因工程技术表达、纯化katG蛋白,通过Westem blotting分析其抗原性,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rkatG蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体.结果重组质粒pET24b-katG 在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28.2%～56.3%左右,分子质量约为80 000,Western blotting分析与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性.纯化后的rkatG样品经SDSPAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为92.75%,每100 ml培养菌可获得28 mg左右的重组蛋白.以33例正常人血清的OD值+2 s为正常界限值,一步法的特异性和敏感性分别为87.9%(29/33),65.6%(21/32);PPD分别为93.9%(31/33),62.5%(20/32);rkatG分别为97.0%(32/33),15.2%(5/33).结论pET24b-katG大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rkatG蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性,但检测抗结核抗体的灵敏度低.【总页数】3页(P41-43)【作者】吴雪琼;张俊仙;张翠英;张妍;王安全;金关甫【作者单位】中国人民解放军第三O九医院结核病研究室,北京100091;中国人民解放军第三O九医院结核病研究室,北京100091;中国人民解放军第三O九医院结核病研究室,北京100091;中国人民解放军第三O九医院结核病研究室,北京100091;中国人民解放军第三O九医院结核病研究室,北京100091;中国人民解放军第三O九医院结核病研究室,北京100091【正文语种】中文【中图分类】R52【相关文献】1.结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究 [J], 王海英;刘志敏;郑建礼;邓云峰2.结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值 [J], 吴雪琼;张俊仙;王安生;张妍;周文强;郑冬燕;何菊芳;张涛3.结核杆菌基因组RD1区毒力蛋白分泌相关基因Rv3871的克隆、表达及生物信息学分析 [J], 鲍一歌;秦紫芳;鲍朗4.结核分支杆菌分泌蛋白Mtb81克隆、表达、纯化及血清学诊断价值的初步研究[J], 李香兰;张广宇;吴雪琼;李建行;陈素丽;谢兰品5.耐多药结核杆菌分离株KatG及inhA基因变异的研究 [J], 朱叶元;邵寒霜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人IL-1Ra基因的克隆及原核表达的研究
通过 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ从人的胎盘组织 中克隆 了人 ，—Ｒ 基 因，使 其在大肠杆茵Ｄ ５ｔ Ｌ Ｉａ Ｈ ｃ中重组表 达。结果表 明，克隆到 了
４ ０ｂ ６ ｐ左右 的 目的基 因，并在 大肠杆 菌 中成 功表 达 了１ ｕ ８ｋ 左右的 目的蛋 白， 目的蛋 白在大肠杆 菌中表达量 占总
蛋 白 ２ ％左 右 ， 为 Ｉ－ Ｒ 的 进 一 步研 究及 应 用 奠 定 了基 础 。 ０ Ｌ１ａ 关 键 词 ：人 Ｉ— Ｒ ；基 因重 组 ；原核 表 达 Ｌ ｌａ
中图分类号 ：Ｑ ｏ ５３
文献标 志码 ：Ａ
文章编号：１０ — ３ ９ ２ １ ）３ ０４ — ５ ０ ５ ９ ６ （０ １０ — １０ ０
白 的表 达情 况 。 阴性 对 照 为在 同等 条 件 下 ３ ０℃培 养 的菌体 ，具体 制样过 程见 １１。 ．１
。
以上 连 接 体 系 １ ６℃反 应 ３ ｉ 转 化 ０ｍ ｎ后
（ 自Ｔａｇｎ 购 ｉ ｅ 博迈 德生物 ） ｎ ；其 他试 剂均 为 Ｓｇ ａ ｉｍ 公
司或 国产 分析纯 生化试 剂 。
１ Ｐ ． ４ ＣＲ引物
Ｘ １Ｂｕ 感受 态细菌 ，３ Ｌ 一 ｌｅ ７℃培养 过夜 。
１ 表达 质粒 的构建 ． ９
１１ 重组 蛋 白诱 导表 达 － Ｏ
根据 已报 道 的人 Ｉ～ Ｒ Ｌ １ ａ基 因序 列 ｇ： ２ ７ ｉ３ ５ ６的
成熟肽设 计 Ｐ Ｒ引物 ，引物 在 Ｉ酶切 位 点 ，３ 物 中导 人 Ｐｔ 吲 ｃ 吲 ｓ Ｉ 酶切位 点 （ 划线 部分 ） 。
３引 物 ：５Ｃ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ ’ ’Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｇ
大肠杆菌表达宿主的特点
大肠杆菌表达宿主的特点1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET 系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage 载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lac Ⅹ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC 序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。
人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
１ 实 验
１１ 材料 ．
产物 转化 大 肠 杆 菌 ＴＧ１ 。提 取 转 化 子 的 质 粒 酶 切 鉴 定， 筛选 出 阳性 克 隆 ， 名为 ｐ Ｔ３ ａｈ 命 Ｅ ０ －Ａ Ｉ。
１２ ３ 基 因工程 菌 的构建 ．． 将 ｐ Ｔ３ ａｈ Ｉ转 化至 宿 主菌 Ｂ ２ （ ３ ， 建 Ｅ ０－Ａ Ｌ １ ＤＥ ） 构 基 因工 程 菌 Ｂ ２ （ ３ （ Ｅ ０－Ａ 。 同 时转 化 Ｌ １ ＤＥ ） ｐ Ｔ３ ａｈ Ｉ） ｐ Ｔ ０ 至 Ｂ ２ （ ３ ， 建 Ｂ ２ （ Ｅ ） ｐ Ｔ３ ａ Ｅ ３ａ Ｌ １ ＤＥ ） 构 Ｌ １ Ｄ ３ （Ｅ ０） 工程菌 作 为阴性 对照 。 １ ２ ４ 蛋 白的诱 导 表达 ．．
关 键 词 ： Ｉ型 精 氨 ｜ 酶 Ｉ 隆 Ｉ 肪 杆 蕾 Ｉ 达 人 ｜ Ｌ 克 大 表 中 圈分 类 号 ： ７ Ｑ ８ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ ２ ５ ２ （Ｏ ７Ｏ －０ ５ －０ １７— ４５２Ｏ） １ ０３ ２
） 约 ３ Ｄ 处有 明 显 的蛋 白表 达 。 在 ５ｋ
端 分别 加上 Ｎｄ ｅ Ｉ和 Ｅ ｏ ｃ Ｒ Ｉ酶切 位 点 。Ｐ的 Ｔ７ＲＮ 聚 合 酶启 动 子 。南 京 Ａ
理 工 大学在 ２ ０ ０ ６年尝 试 了在毕 赤 酵母 工 程 菌 表达 人 Ｉ型精 氨酸 酶 ， 表达 的蛋 白没有 分泌 到酵母 细 胞外 ， 但
１ １ １ 菌株 和质粒 ．． 大肠 杆 菌 表 达 载 体 ｐ Ｔ ０ Ｅ ３ ａ及 宿 主 菌 Ｂ ２ Ｌ１
（ ３ ， ｖ ｇ ｎ公 司 。毕 赤 酵 母 表 达 载 体 ｐ Ｉ ９ ＤＥ ） Ｎｏ ａ ｅ Ｐ Ｃ Ｋ－ ｈ Ｉ为本 实 验 室 构 建 ， 肠杆 菌 ＴＧＩ由本 实 验 室 保 Ａ 大