吡哌酸分子印迹聚合物的分子识别

收稿日期:2005211215 修回日期:2006203209通讯联系人:杜黎明,男,教授,博士生导师,从事有机分析及药物分析研究.第23卷第1期Vol.23　No.1分析科学学报J OU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE 2007年2月Feb.2007文章编号:100626144(2007)0120061204吡哌酸分子印迹聚合物的分子识别曹玺珉,杜黎明3,张　敏(山西师范大学分析测试中心,山西临汾041004)摘　要:采用分子印迹技术合成了吡哌酸分子印迹聚合物。

运用平衡结合实验研究了聚合物的吸附特性和选择性识别能力。

Scatchard 分析表明,在本文所研究的浓度范围内,聚合物中形成了两类不同的结合位点。

吡哌酸分子印迹聚合物对吡哌酸呈现较高的选择识别特性,可作为固相萃取剂,在人血清吡哌酸的分析中对样品进行了有效的提取和净化。

关键词:分子印迹技术;吡哌酸;分子印迹聚合物;分子识别;固相萃取中图分类号:O657.32 文献标识码:A分子印迹是制备对印迹分子具有预选性聚合物的技术,其关键是制备对印迹分子具有特异选择性且高度稳定的聚合物。

这类聚合物具有识别性能好、选择性可预定、化学性质稳定、对环境耐受性强和制备相对简单等优点,在色谱分离、抗体仿生、固相提取等领域[1-4]都具有广阔的应用前景。

吡哌酸(Pipemidic Acid ,PIP )是一种广泛应用于临床的喹诺酮类抗菌素,存在刺激肠胃、损坏肾功能等毒副作用。

因此,控制并检测其在人体中的含量,对达到最佳治疗效果及最小的毒副作用有着重要的意义。

本文以吡哌酸为印迹分子,采用分子印迹技术合成了对吡哌酸有特效选择性吸附的分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer ,M IP )。

通过平衡结合实验对其吸附性能和选择性进行研究,结果表明,吡哌酸分子印迹聚合物对吡哌酸有较大的吸附性能和高度的选择性。

将吡哌酸分子印迹聚合物作为固相吸附剂,从人血清中萃取提纯药物吡哌酸,获得比较满意的结果。

1　实验部分1.1　主要仪器与试剂UV 22201型紫外可见分光光度计(日本,岛津公司);LS 250B 型荧光分光光度计(美国,Perkin Elmer 公司);SHA 2B 型双功能水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司);3K 30型冷冻高速离心机(Sigma 公司)。

吡哌酸,依诺沙星,司帕沙星,羟氨苄西林(中国药品生物药品检定所);α2甲基丙烯酸(MAA ,分析纯)使用前重新蒸馏除去阻聚剂;42乙烯基吡啶(42V P ,Fluka 化学公司);偶氮二异丁腈(A IBN ,化学纯);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA ,化学纯);乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

1.2　吡哌酸分子印迹(MIP)聚合物的合成称取0.3574g (1.0mmoL )PIP ,溶于20mL 乙腈和N ,N 2二甲基甲酰胺(DM F )混合溶剂中(8∶2,V /V ),加入0.5165g (6.0mmoL )功能单体MAA ,充分搅拌,再加入0.3154g (3.0mmoL )功能单体42V P ,置于振荡器中室温下振荡6h ,使MAA 、42V P 与PIP 充分作用,然后依次加入5.9466g (30.0mmoL )交联剂EGDMA 和40mg 引发剂A IBN ,转入50mL 安培瓶中,充分混匀,通氮气2min ,抽真空2min ,重复操作3次,在真空下封管,置于60℃恒温水浴中振荡24h ,得到疏松块状聚合物。

将聚合物放入PVC 离心管中,加入8∶2(V /V )的0.02mol/L NaO H/甲醇溶液,超声洗脱5min ,高速离心分离,弃去离心液,反复操作,直至用紫外可见分光光度计检测不到离心液中的印迹分子,再用甲醇洗至中性,放入第1期曹玺珉等:吡哌酸分子印迹聚合物的分子识别第23卷真空干燥器于60℃条件下干燥至恒重。

NM IP的合成除不加PIP外,其余步骤同上。

1.3　平衡结合量的测定准确称取印迹或非印迹聚合物20.0mg,放入10mL磨口锥形瓶中,加入2.0mL已知浓度的PIP或其它底物的乙腈/DMF(8∶2,V/V)溶液,放入恒温水浴振荡器中室温下振荡16h,然后将此混合液转入高速离心机中离心5min,取适量的离心液,用乙腈稀释至一定体积,用紫外分光光度计测定PIP或其它底物的平衡浓度,根据结合前后溶液中浓度的变化,计算M IP和NM IP对底物的结合量Q,平行测定3次,取平均值。

吸附底物后的M IP和NM IP,按照除去印迹分子的方法洗去底物,干燥后可重复使用。

1.4　MIP对人血清中PIP的固相萃取净化于离心试管中加入1mL空白人血清,一定量的PIP,2mL甲醇,振荡5min,以10000r/min离心5min,用荧光分光光度计按文献[5]的方法测定上层清液中的PIP含量,计算回收率。

自制固相萃取柱内装250mg M IP,用1∶1(V/V)的水/甲醇溶液活化。

吸取上层清液0.5mL,注入萃取柱,然后依次用1mL乙腈、1mL水各清洗2次,真空抽干。

最后用8∶2(V/V)的NaO H(0.02mol/L) /甲醇溶液洗脱,每次用0.5mL,共洗5次,合并洗脱液。

用荧光分光光度计按文献[5]的方法测定洗脱液中PIP的含量,计算回收率。

2　结果与讨论2.1　PIP与功能单体的作用方式考虑到PIP的溶解度和溶剂的极性,选用体积比为8∶2的乙腈、DM F混合溶液作溶剂。

PIP分子中的氮原子和羧基中的羟基可以与功能单体以氢键或静电作用相结合,形成络合物[6,7]。

由此可推测PIP 与功能单体MAA和42V P的作用方式如图1所示。

Fig.1　Schematic representation of the prep aration of MIP2.2　MIP的结合性质取一组质量相同的MIP和NMIP,测定它们对不同浓度PIP的结合量,绘制结合等温线(见图2)。

从图2可以看出,在所研究的浓度范围内,MIP的结合量随着溶液浓度的增大逐渐增加,而NMIP的结合量却趋于饱和,MIP的结合量显著大于NMIP的结合量。

说明组成相同的两种聚合物的空间存在明显的差异,MIP包含有固定排列的功能基的空间空穴,两种聚合物的吸附量的差值主要来源于这种空穴的选择性吸附。

根据Scatchard方程Q/[PIP]=(Q max-Q)/K d(K d为结合位点的平衡离解常数,Q max为结合位点的最大表观结合量)作图(见图3),由图3可见,Q/[PIP]对Q明显是非线性关系,说明M IP对PIP的结合位点并不是等价的,而图中两条直线所显示的部分各自均有良好的线性关系,这证明在所研究的浓度范围内,印迹聚合物含有两类不同的结合位点。

由它们的斜率和截距求得亲合力较高和亲合力较低的结合点的离解常数分别为K d1=1.34×10-4mol/L和K d2=1.94×10-3mol/L,其最大表观结合常数分别为Q max1=29.2μmol/g和Q max2=178.3μmol/g。

两类结合位点产生的原因可能是在聚合前或期间的反应溶液混合物中,MAA和PIP形成络合物或MAA与42V P同时与PIP形成络合物,这两种不同的络合物经第1期分析科学学报第23卷交联剂交联均可进入聚合物母体中,形成了两种不同结合性质的孔穴。

Fig.2　Binding isotherm of MIP and NMIPQ :amount of PIP bound to 20.0mg MIP or NMIP ;adsorption time :16h ;ambient temperature :t =25℃;V =2.00mL.Fig.3　Scatch ard plot to estim ate the binding na 2ture of MIP2.3　MIP 对底物的选择性采用静态吸附分配系数K D 来表征印迹聚合物对不同底物的选择性。

选用结构相似的依诺沙星、司帕沙星、羟氨苄西林作为底物进行了选择性实验,用平衡结合方法测定了M IP 及NM IP 的结合量,由式K D =c p /c S (c p 表示聚合物结合底物的浓度,c S 表示溶液中底物的平衡浓度)计算所选底物在溶液和聚合物间的结合分配系数K D (表1)。

T able 1　K D of tested substrates on MIP and NMIP under equilibrium binding conditionsSubstratesMIP NMIP Pipemidic Acid55.825.5Enoxacin33.623.1Sparfloxacin35.126.4Amoxicillin 8.28.2Unit :mL/g ;amount of polymer :20.0mg ;initial concentration of t he subst rates :2.0mmol/L ;V :2.00mL ;binding time :16h.由表1可见,M IP 对PIP 展现了高的选择识别性能,由于依诺沙星、司帕沙星与PIP 在结构上存在一定差异,M IP 对其的选择性和识别能力明显降低。

羟氨苄西林结构与PIP 相差较大,M IP 对羟氨苄西林没有呈现特异的结合性和选择性。

NM IP 与M IP 的化学组成相同,但它没有形成化学功能基与印迹分子互补的分子识别点,官能团在NM IP 中的分布是任意的,仅靠弱的非选择性吸附结合底物。

2.4　印迹聚合物的固相萃取分子印迹聚合物对印迹分子具有独特的高亲和能力和高选择性,可以对样品进行浓缩、提纯,减少干扰物质的影响,提高分析结果的准确性,降低检出限[3,4]。

用所合成的M IP 作为固相吸附剂对人血清中的PIP 进行分离提纯,表2中列出了加入PIP 的人血清预处理后直接测定和用PIP 印迹聚合物固相提取后PIP 的测定结果。

结果表明,没有净化的血清样品中的PIP 回收率很低,通过分子印迹聚合物固相萃取(M ISPE )方法处理,PIP 检测回收率得到了很大的提高。

说明M IP 的固相萃取去除了血清中的干扰组分,净化了样品,使样品中的PIP 可以用光谱分析法直接测定,简便、快捷,克服了色谱分析生物样品过程繁杂,成本高,时间长等缺点。

T able 2　R esults from the analysis of unpurif ied and MISPE 2purif ied extracts of pipemidic acid 2spiked hum an serum Amount spiked(μg/mL )Unpurified MISPE 2purified Mean amount found (μg /mL )Recovery (%)Mean amount found (μg /mL )Recovery (%)21.3869.2 1.8089.953.6873.64.4889.6107.2472.49.1391.33　结论分子印迹聚合物呈现出一定的“记忆”功能,对印迹分子表现出特效的分子识别性能。