药物递呈载体对提高CpG-DNA免疫刺激活性的作用
2024北京高三二模生物汇编：稳态与调节(非选择题)
2024北京高三二模生物汇编稳态与调节（非选择题）一、非选择题1．（2024北京西城高三二模）科研人员对生长素（IAA）参与莲藕不定根（Ar）形成的调控机制进行了一系列研究。
(1)研究发现，10μmol·L-1的IAA能显著促进莲藕Ar的形成，而150μmol·L-1的IAA则起到抑制作用，这体现了IAA的作用具有的特点。
后续研究中IAA处理组均选用10μmol·L⁻¹作为处理浓度。
(2)植物下胚轴分生组织的细胞经发育成根原基（Rp），继续发育并突破表皮形成Ar，研究者通过显微结构观察莲藕Ar的发育过程，结果如图1。
结果表明，IAA通过从而促进了Ar的生长。
(3)IAA氧化酶（IAAO）能氧化分解IAA。
研究者进一步检测了实验组和对照组IAAO活性和内源IAA含量，结果如图2。
据图2推测，施加IAA后促进Ar生长的原因是。
(4)在生长素介导的信号转导机制中，ARF和AUX起到重要作用（图3）。
研究者进一步检测了ARF基因的相对表达量（图4）。
结合图3和图4阐释施加IAA促进莲藕Ar形成的分子机制。
2．（2024北京东城高三二模）哺乳动物幼崽的母亲依恋行为是生命历程中的第一种社会行为，近期我国科学家揭示了该行为的调控机制。
(1)神经调节的基本方式是。
母亲气味作为刺激，使幼崽的相关感受器产生兴奋，兴奋沿着传入神经向传导，经过综合处理最终使幼崽表现出母亲依恋行为。
(2)基因T表达产物是神经递质5-羟色胺（5-HT）合成必需的酶。
为探究5-HT对幼鼠母亲依恋行为的影响，取一对基因T缺失突变杂合小鼠（+/-）进行杂交，利用杂交子代幼鼠进行如下实验。
①如图1．在测试盒子的两侧分别放置来自幼鼠母亲的巢穴物品（A）和未使用过的巢穴物品（B），幼鼠放置在中间空白处，统计幼鼠在两侧的停留时间，结果如图2所示。
实验结果说明。
①为进一步证实上述结论，研究人员对①操作进行了改进：将未使用过的巢穴物品替换为其他雌鼠的巢穴物品，其余处理均相同。
兽用免疫佐剂的研究进展
兽用免疫佐剂的研究进展高泽乾;孙建男;武炜;李成会【摘要】佐剂可以增强机体对抗原的免疫应答反应,可以显著增强疫苗的免疫效果。
综述了在兽用疫苗研究领域中常用的免疫佐剂,并对佐剂的发展趋势作了展望。
%Adjuvant can improve the body＇s immune response to antigen and play an extremely important role to enchance vaccine effect.In accordance with consulting lots of Chinese and English literature,we review the research progress of the vaccine adjuvants commonly used in veterinary and prospect the development trend of the veterinary vaccine.【期刊名称】《唐山师范学院学报》【年(卷),期】2012(034)002【总页数】5页(P45-48,51)【关键词】免疫佐剂;免疫应答;疫苗【作者】高泽乾;孙建男;武炜;李成会【作者单位】唐山师范学院生命科学系,河北唐山063000;唐山师范学院生命科学系,河北唐山063000;唐山师范学院生命科学系,河北唐山063000;唐山师范学院生命科学系,河北唐山063000【正文语种】中文【中图分类】S825.4随着现代生物化学技术的飞速发展，兽用疫苗的研发获得了巨大成功，经历了从灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等传统疫苗到基因工程疫苗、合成肽疫苗、转基因植物疫苗等新型疫苗的演变[1]。
新型兽用疫苗与传统兽用疫苗相比，具有良好的抗原特异性和低毒性，但由于其抗原分子小，纯化程度高，疫苗的免疫原性较差。
所以应用佐剂来增强疫苗免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答就显得尤为重要。
CpG—DNA免疫佐剂作用研究进展
果 Ｃ Ｇ缺失或胞嘧啶发生甲基化 ，则其活性丧失。Ｋ ｉ ｐ ｒｇ ｅ 等认为有最强免疫刺激作用的 Ｃ Ｇ序列，至少应有 ８ ｐ 个 碱基 ，且其碱基序列大多有一定的规律 ： ｐ Ｃ Ｇ两侧序列需
为 ２ ５嘌呤 和 ２ ３嘧啶 ， 个 ’ 个 ’ 且当 ５端为 Ｇ Ａ ３端 为 ’ ｐ 、’
景 作 一 简要 介 绍 。 关键 词 ： ｐ － ＮＡ ； 疫 佐 荆 ＣＧ Ｄ 免 中图 分 类 号 ：８ ２ ＊ ￥ ５． ３ ４ 文献标识码 ： Ａ
பைடு நூலகம்
Ｒ ｓａ ｃ ｒ ｇ ｅｓ ｆ ｐ Ｄ Ａ Ａ ｊａ ｔ ｅｅｒｈＰ ｏ ｒｓ ｏ Ｇ－ Ｎ ｄｖ ｎｓ Ｃ
ＬＩ ｎ～ｈ ａ Ｕ Ｙａ ｕ ｎ， Ｍ Ｉ ＡＯ —ｇ ａ ｇ， ＡＮ Ｇ ｉ ａ ｇ Ｌｉ ｕ ｎ Ｗ Ｚｈ —ｇ ｎ
些含有 １ 个或多个回文序列的 Ｏ ＤＮ才具有免疫学活性 。 通过对 ＯＤ 的进一步检测发现 ，只有含有非甲基化的 Ｎ
Ｃ ＧＯＤ ｐ Ｎ才具有免疫刺激作用 ， 而甲基化的 Ｃ Ｇ ＯＤ ｐ Ｎ
或将 Ｃ Ｇ替换成 Ｇ ｐ Ｃ或其它序列 ， 则丧失其免疫活性 。 因
Ｔ Ｃ或 Ｔ Ｔ时活性最强日 Ｃ Ｇ Ｄ ｐ ｐ 。 ｐ － ＮＡ的骨架修饰也 与其
Ｃ Ｇ— Ｎ ｐ Ｄ Ａ免 疫 佐 剂 作 用 研 究 进 展
刘艳 环， 苗利 光 ， 王志 刚
（ 中国农业科学院特产研究所 ， 吉林 吉林 １２ ０ ） ３ １９
摘 要 ： ｐ — Ｃ Ｇ ＤＮＡ是一些具 有免疫激 活功能的 以未甲基 化的 Ｃ Ｇ￣， （ ｐ 为核 心 的 ＤＮＡ序列 ， 包括含 Ｃ Ｇ基 ｐ ｑ Ｃ Ｇ ｍｏ － 它 ｐ 序的人工合成 的寡 聚脱 氧核苷酸（ｈ ｏ ｅｘ ｎ ｃ ｏｉｅ， ０ ｇ ｄｏ ｙ ｕｌ ｔ ｓＯＤＮ） 自然界 中细菌、 ｅ ｄ ￣ 病毒 、 无脊椎动物 等低等 生物 的基 因组 ＤＮＡ。
纳米载体递送技术
纳米载体递送技术介绍纳米载体递送技术（Nanoparticle drug delivery technology）是指利用纳米尺度的载体，将药物有效地输送到靶向组织或细胞的技术。
该技术采用纳米材料作为药物的载体，具有良好的生物相容性、药物稳定性及可控释放性。
纳米载体递送技术在药物输送和癌症治疗等领域具有广阔的应用前景。
优势纳米载体递送技术具有以下几个优势：1.靶向性：纳米载体可以通过表面修饰，实现对靶向组织或细胞的选择性识别和递送。
这可以提高药物在靶向组织或细胞的局部浓度，减少对正常组织的损伤。
2.控释性：纳米载体具有可控释放药物的性质，可以实现药物的持续释放或延时释放，从而提高药物的疗效和降低副作用。
3.生物相容性：纳米载体材料通常具有良好的生物相容性，可以避免对生物体的毒副作用，提高药物的安全性。
4.药物保护：纳米载体可以有效地保护药物免受外界环境的干扰，如光、酸碱等，从而提高药物的稳定性。
纳米载体的类型纳米载体递送技术包括多种载体类型，常见的有：1. 纳米粒子纳米粒子是一种常用的载体类型，可以通过改变纳米粒子的大小、形状和表面性质来实现对药物的控制释放和靶向递送。
2. 脂质体脂质体是由磷脂类物质组成的微囊，具有良好的生物相容性和药物包封能力。
脂质体可以通过改变脂质体的结构和组分，实现对药物的控制释放和靶向递送。
3. 聚合物纳米颗粒聚合物纳米颗粒由聚合物材料构成，具有良好的生物相容性和可控释放性。
聚合物纳米颗粒可以通过调整聚合物的结构和化学反应来实现对药物的控制释放和靶向递送。
4. 纳米骨架纳米骨架是一种由无机材料构成的纳米结构，具有高稳定性和大孔道容积。
纳米骨架可以通过改变骨架材料和孔道结构，实现对药物的控制释放和靶向递送。
纳米载体递送技术的应用纳米载体递送技术广泛应用于药物输送、癌症治疗和基因治疗等领域。
1. 药物输送纳米载体递送技术可用于改进传统药物的输送方式，提高药物的生物利用度和治疗效果。
细菌CpG-DNA对犬免疫增强效果的研究
细菌CpG-DNA对犬免疫增强效果的研究
郭爱珍;唐泰山;陆承平
【期刊名称】《中国兽医科技》
【年(卷),期】2001(31)12
【摘要】以犬瘟热病毒为模式病毒 ,将CpG DNA与铝胶、蜂胶 2种对照佐剂分别与犬瘟热病毒灭活疫苗配合 ,给犬接种疫苗前后用微量中和试验抽查血清中和抗体效价 ,根据抗体效价高低判断佐剂的免疫增强效果。
结果表明 ,3种佐剂疫苗均能诱导产生特异性抗体 ,但组间抗体效价有显著差异 (P <0 .0 1 ) ,CpG DNA的免疫增强作用明显高于其它 2种佐剂 ,CpG DNA所诱导的抗体效价较蜂胶佐剂高 5倍 ,较铝胶佐剂高 7倍。
【总页数】3页(P6-8)
【关键词】CpG-DNA;免疫增强剂;犬瘟热病毒;免疫增强效果
【作者】郭爱珍;唐泰山;陆承平
【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S852.4;S852.655
【相关文献】
1.缓释复方免疫增强剂对4种鸡传染病疫苗免疫增强效果研究 [J], 刘瑞生;薛掌林;张述斌;王必慧
2.缓释复方免疫增强剂对四种鸡病疫苗免疫增强效果研究 [J], 刘瑞生;薛掌林;张述
斌;王必慧
3.缓释复方免疫增强剂对4种鸡传染病疫苗免疫增强效果研究 [J], 刘瑞生;薛掌林;张述斌;王必慧
4.细菌DNA对小鼠接种犬细小病毒灭活苗的免疫增强效果 [J], 唐泰山;郭爱珍;陆承平
5.细菌CpG-DNA免疫刺激活性研究进展 [J], 郭爱珍;陆承平
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CpG_DNA疫苗佐剂研究进展及其应用前景
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BCG—CpG—DNA制备、理化特性及免疫刺激活性的初步研究
BCG—CpG—DNA制备、理化特性及免疫刺激活性的初步研究微生物学免疫学进展2005年第33卷第1期BCG.CpG—DNA制备,理化特性及免疫刺激活性的初步研究赵爱华,贾淑珍,乔来艳,寇丽杰,王国治(中国药品生物制品检定所,北京100050)摘要:采用机械破碎,CTAB沉淀,酚:氯仿:异戊醇抽提法从卡介菌(BCG)中制备BCG-CpG-DNA,经化学方法确定其理化成分,通过双抗体夹心ELISA法检测小鼠IgM水平检测其免疫刺激活性.结果显示每克半干重的卡介菌提取BCG.CpG.DNA约0.9mg.提取物主要成分为BCG-CpG-DNA,分子量大小在3000～15710bp,含少量的多糖和蛋白;紫外分光扫描在260nm有最大吸收;对特异性识别DNA长链的CCGG中的CpG位点的限制性内切酶HpaⅡ高度敏感;能够活化小鼠B细胞产生IgM.所制备的BCG-CpG-DNA含较多的未甲基化CpG基序,具有免疫刺激活性功能.关键词:BCG-CpG-DNA;卡介菌(BCG);CpG基序中图分类号:R378.911文献标识码:A文章编号:1005-5673(2005)0l-0039-05 BCG?CpG?DNAisolation-physicochemicalcharacterizationandthefunctionofZ0A. hua.JIAShu-zhen,QIAOLai-yan-eta1.(NationalInstitutefortheControlofPharmaceutical andBiologicalProducts,曰eng100050.China)Abstract:Usingthefollowingmethodsincludingmechanicaldisruption.precipitatedwithC TAB,extractedwithPhenol:cMom~rm:isoamylalcohol,BCG-CpG-DNAwaspreparedfromMycobacteriumbovisstra inBCG.Indetectionofimmunos-timulatoryfunction,thedoubleantibodiessandwichELISAwastakentodeterminemouseIg Msecretion.ResetsshowedthatBCG-CpG-DNAisthemaincomponentoftheDNAfractionwithlowamountofproteina ndpolysaccharide.BCG-CpG-DNAisabout3000～15710bp,showinganabsorptionmaximumat260nmandanabsorptionminimumat230nm. There-strictionenzymeHpaIIrecognizesthesequenceCCGG-andcutsthissitewhentheinnercytidi neisunmethylated.BCG-CpG-DNAissensitivetoHpaIIdigestionbycleavedas100～250bpfrom3000～15710bp.anditcanactiviateIsMse-cretionfrommouseBcells.ThisindicatedthatthereareplentyofunmethylatedCpGmotifsin BCG-CpG-DNA,whichhaveimmunostimulatoryfunctions.Keywords:BCG-CpG-DNA;BCG;CpGmotifsCpGDNA能被脊椎动物免疫系统抗原呈递细胞(APC),主要是DC细胞,巨噬细胞,B细胞的TLR.9识别¨4.,尤其是DC细胞识别CpGDNA后,产生IL—l2,IL—l2能对T细胞功能性分化(ThO向Th1)提供指令性信息,是连接天然免疫和获得性的一个重要纽带,从而有效的提高机体细胞免疫防御功能.细菌是未甲基化CpGDNA的丰富来源之一.从实验的卡介菌中制备CpGDNA,称之为BCG—CpG—DNA,并对其理化特性及免疫刺激活性进行初步研究.材料和方法1材料收稿Et期:2004-08—16;修回Et期:2004—11—15作者简介:赵爱华(1974一),女,医学硕士,实习研究员,主要从事疫苗免疫药理,毒理研究.391.1菌种国家标准卡介菌株上海DPB302S,由中国药品生物制品检定所菌苗室提供.1.2主要生化试剂酚,氯仿,异戊醇,无水乙醇等均为国产分析纯试剂.溴化十六烷基三甲基铵(CTAB),天冬素,溴化乙锭(EB)为Sigma产品.琼脂糖凝胶(Pro—mega),HpaI1限制性内切酶(NewEnglandBiola—bs).DNAMarker:lambda—EcoT14digestDNAMark—er,marker2000bp(TaKaRa),无水葡萄糖,牛血清白蛋白标准品为中国药品生物制品检定统一标定参考品.1.3主要仪器设备高速冷冻离心机(日立)紫外一可见分光光度计(UV-2401PC岛津)电泳仪(EPS301,Phamacia)水平电泳槽(GNA一100Phamacia)凝胶成像系统(柯达).1.4培养基马铃薯苏通培养基和改良的液体苏通培养基.1.5实验动物BALB/c小鼠(SPF),8～10w龄,雌性,购自中国药品生物制品检定所动物中心.2方法2.1BCG—CpG—DNA的制备2.1.1菌体制备按《中国生物制品规程》(2000)版中卡介菌的菌种传代要求进行,卡介菌在液体苏通培养基培养14～20d时,培养瓶经逐瓶检查后,收集菌膜,加入适量去离子蒸馏水洗涤,压干后称重. 2.1.2菌体破碎将收集的菌体以去离子蒸馏水按1g/ml混匀,以组织捣碎匀浆机(12000r/min)破碎菌体,3min×3次.2.1.3BCG—CpG—DNA的提取方法参考文献J菌体破碎,高速冷冻离心,收集上清,CTAB沉淀,沉淀溶于1mol/,L的NaCI,加入相同体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤,溶解于TE缓冲液(Tris—C1pH8.0)中,透析, 0.45m无菌滤器除菌过滤,一20~C保存.2.2BCG—CpG—DNA紫外吸收图谱扫描将BCG—CpG—DNA原液用TE缓冲液做100倍稀释,以TE缓冲液做空白对照,对稀释的溶液进行220～300nm下的光密度值(A)扫描,观察图谱特征,并确定230nm,260nm,270nm,280nm的光密度值(A),计算A260:A23oA260:A28oA260:A27o的比值.2.3化学组分的定量2.3.1提取物中BCG—CpG—DNA的定量DNA紫外分光法定量,方法参考《分子克隆第三版》(A8.21).2.3.2提取物中的多糖的定量方法参考《中国生物制品规程》(2000)版的蒽酮法.2.3.3提取物中的蛋白的定量方法参考《中国生物制品规程》(2000)版的Lowry法.2.4水平凝胶电泳法确定BCG—CpG—DNA分子量将BCG—CpG—DNA样品做不同的稀释,加入0.微生物学免疫学进展2005年第33卷第1期7%～1%的凝胶泳道中,缓冲液为1×TAE,电压60～100V,采用lambda—EcoT14digestDNAMarker和marker20OObp为分子量标准,凝胶采用EB(0.5g/m1)染色.柯达凝胶成像系统进行结果观察,判断DNA的纯度,并用Kodak1D3.5分析软件确定BCG—CpG—DNA分子量的大小.2.5BCG—CpG—DNA对限制性内切酶Hpa1I的反应2.5.1限制性酶切反应限制性内切酶HpaⅡ特异性识别DNA长链的CCGG中的CpG位点,并将DNA切割成小片段.根据生产商的建议,分别将1Ixl约500ng的BCG—CpG—DNA样品加入到10l的Hpa1I限制性酶切反应体系中,37~C作用1h.2.5.2限制性酶切反应结果观察分别将HpaⅡ酶切处理过和未处理的约500ng的BCG—CpG—DNA 样品加入0.7%一1%的凝胶泳道中,缓冲液为1×TAE,电压60～lOOV,采用lambda—EeoT4digestDNA Marker和marker200Obp为分子量标准,凝胶采用EB染色,浓度为0.5g/ml.柯达凝胶成像系统观察BCG—CpG—DNA对限制性内切酶Hpa1I的反应.2.6小鼠脾细胞的制备和活化常规制备BALB/c小鼠脾单个核细胞(MNC),用完全培养基调整细胞浓度1×10./ml,接种96孔细胞培养板,每孔2001xl,另加指定浓度BCG—CpG—DNA.5%CO,37~C全湿润培养68h.用双抗体夹心ELISA法检测上清中IgM水平.2.7双抗体夹心ELISA法检测小鼠IgM羊抗小鼠IgM(SouthernBioteehnologyAssoci—ates.Inc)包被96孔酶标板,500ng/100ul/~L,4~C过夜.加入待检细胞培养上清,37~C作用2h,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgM(Sigma),37~C作用1h,OPD显色适当时间,用0.67mol/LHSO终止反应并测定吸光度值A492nm.结果1BCG-CpG-DNA提取率按每克半干重卡介菌所能提取的BCG—CpG—DNA的量来计算提取率,结果见表1.表1BCG-CpG-DNA产量Table1TheyieldofBCG-?CpG??DNA微生物学免疫学进展2005年第33卷第1期由表1可见,大约每克半干重卡介菌可提取约0.9mgBCG.CpG.DNA,BCG—CpG—DNA提取率为0.88%o一0.92‰.2BCG-CpG-DNA扫描结果对所提取的BCG.CpG—DNA进行220～300nm条件下的A值紫外吸收扫描,图谱显示在260nm附近有最大吸收,230nm有最小吸收.A∞:A.,A260:A28.的比值均达到2.2和I.8,A260:0D2为为1.2左右.说明所提取的DNA纯度较高,蛋白,多糖,酚的残留都达到较低水平,结果见图1,表2.41Wavelength(nm)图1BCG-CpG-DNA紫外吸收扫描图谱Fig.1UV absorptionofBCG—CpG—DNA表2BCG—CpG—DNA的扫描结果Table2UV absorptionofBCG?-CpG?-DNA3BCG-CpG-DNA中各化学组分含量测定对所提取的BCG—CpG—DNA中各化学组分进行含量测定,结果显示BCG—CpG—DNA是核酸,多糖, 蛋白的混合物,但是DNA为主要成分,BCG—CpG—DNA的浓度是多糖浓度的7倍左右,是蛋白浓度的150倍左右,结果见表3.表3BCG-CpG—DNA中各化学组分含量Table3Chemic~compositionofBCG?-CpG?-DNA4BCG-CpG-DNA分子量大小将BCG—CpG—DNA样品0928分别做7倍,100倍稀释;1230做5倍,100倍稀释,各取3l,加入0.7%琼脂糖凝胶泳道中进行电泳,以确定分子量大小,结果见图2.由图2可见,提取的BCG—CpG—DNA纯度较高.经Kodak1D3.5软件分析,其分子量大小在3000—15710bp之间,平均分子量在6000bp左右.5BCG-CpG-DNA对限制性内切酶Hpan反应结果限制性内切酶HpaI1能特异性识别DNA长链的CCGG中的CpG位点,并将DNA切割成小片段, 根据HpaI1处理过的DNA片段大小可以了解DNA 中CpG位点的多少.由于非甲基化的CpG基序是引起DNA免疫刺激活性的必需,因此DNA对Hpa Ⅱ的限制性酶切反应结果能反应DNA免疫刺激活性.图3是BCG.CpG—DNA样品对限制性内切酶HpaI1反应前后的结果比较.图中1,2泳道分别为1230BCG-CpG-DNA对HpaI1反应的前后结果,3,4泳道分别为0928BCG.CpG.DNA对HpaI1反应的前后结果.由实验结果可见,HpaI1能将BCG-CpG-DNA切割成很小的片段,大小在250—100bp之间,结果见图3的2,4泳道;而没加HpaI1处理的DNA片段大小在3000—15710bp之问,结果见图3的1,3泳道.说明所提取的BCG—CpG—DNA含有较多的非甲基化CpG位点.426BCG-CpG-DNA体外刺激小鼠脾细胞产生IgM根据文献报道CpG-DNA体外能直接刺激B淋巴细胞增殖并分泌M…,对BCG-CpG.DNA体外刺激的脾淋巴细胞的培养上清以双抗体夹心ELISA l23466围2BCC~CpC-DNA分子量大小电泳结果Fig.2Determlnationmolecularwei咖ofBCC—Cpc-DNA1.Ltm]3da.Eoo.rI4digestDNAmarker2.1230BCC.-CpG.DNA(5×)3.0928BCG-CpC.DNA(100×)4.1230BCG-CpC,-DNA(100×)5.0928BCC.-CpG—DNA(7×)6.Marker200Obp法检测IgM产生水平.结果见表1.由表1可见BCG?CpC.-DNA体外刺激的脾淋巴细胞的培养上清中IgM水平明显高于对照组(P<0.01),并随BCG—cpGDNA剂量的增加而增高圈3限制性蕊切反应前后结果比较Fig.3SensitivityofBCC,-CpG-DNAtoHpaIIM.marke~000hD1.1230BCC,-C口GDNA2.1230BCC,-CpC.一DNA+HpaⅡ3.0928BCG.CryC..DNA4.0928BCG-CpG.DNA+HpaⅡM.1ambda-Ee棚4digestDNAmarker表4BCG-CpG?DNA免疫刺激蓿性的检测结果Table4DeteminationBCG-CpG-DNAimmunc~llmuIatoryactivity'BCC~CpG.DNA休外刺激脾细胞产生tgM.脾细胞1x10'/ml,2(】ouwel1.低,中,高剂BCC,-CpG?DNA终浓度分别为10.100.2oou,e/ml,68小时培养取培养上清,双抗体夹心ELISA法检测小鼠In=6. 讨论实验制备的BCG-CpG-DNA采用机械破碎,CTAB沉淀,酚:氯仿:异戊醇抽提的方法.结果证明所制备的BCG-CpG—DNA纯度较高,产量较大.提取的结果是每克半干重卡介菌能提取大约0.9ragBCC-CpG—DNA,提取率接近1%o.实验中发现如果破碎的足够充分,BCG—cpG-DNA产量也将提高,甚至可以达到1.5mg半干菌重.BCG—CpC,一DNA紫外分光扫描图谱显示在260nm附近有最大吸收,230nm有最小吸收,260:280,260:230和260:270的比值均分别达到1.8,2.2和】.2.根据分子克隆第三版A8.21的说明,这三个比值分别代表DNA提取后蛋白,多糖及有机溶微生物学免疫学进展2005年第33卷第1期剂特别是酚的残留.当这三个值分别达到1.8,2.2和1.2时,则说明提取的DNA中蛋白,多糖的含量较低,并且无酚残留.BCG—CpG—DNA扫描结果说明该提取物纯度较高,主要成分是核酸,含少量多糖,蛋白.通过对提取物中的化学组分进行定量,结果和扫描结果相一致,提取物的主要成分是BCG—CpG—DNA,其浓度是多糖浓度的7倍左右,是蛋白浓度的150倍左右.电泳结果表明BCG—CpG—DNA为双链DNA,分子量大小在3000～15710bp之间.从对限制性内切酶HpaII的反应结果可见.所提取的BCG—CpG—DNA含较多的CpG位点,通过对小鼠B细胞的活化作用对BCG—CpG—DNA的免疫刺激活性进行检测;结果显示BCG—CpG—DNA能够活化小鼠B细胞产生IgM.该实验主要是制备BCG—CpG—DNA并对其理化特性及免疫刺激活性功能做了初步验证.结果表明所制备的BCG—CpG—DNA含有大量未甲基化CpG基序,具有免疫刺激活性功能.43参考文献:[1]HemmiH,Takeuchi0,KawaiT,eta1.A ToH—likereceptorrec—ognizesbacterialDNA[J].Nature2000,408:740-745.[2]KriegAM.CpGmotifsinbacterialDNAandtheirimmuneeffects [J].AnnuRevInnunol2002,20:709-760.[3]AnH,XuH,YuY,eta1.Up—regulationofTLR9geneexpres—sionbyLPSinmousemacrophagesviaactivationofNF—kappaB, ERKandp38MAPKsignalpathways[J].ImmunolLett2002,81(3):165—169[4]RothenfusserS,TumaE,WagnerM,eta1.Recentadvancesin immunostlmulatoryCpGoligonucleotides[J].CurtOpinMolTher 2003,5(2):98—106.[5]TokunagaT,Y amamotoH,ShimadaS,eta1.Antitumoractivity ofdeoxyribonucleicacidfractionfromMycobacteriumbovlsBCG.I.Isolation,physicochemicalcharacterization,andantitumorac—tivity[J].JNatlCancerInst1984.72:955~62.[6]YiAK,KlinmanDM,MartinTL,eta1.Rapidimmuneactivation byCpGm~ifsinbacterialDNA.SystemicinductionofIL45tran—scriptionthmuanantioxidant—sensitivepathway[J].JImmunol 1996,157(12):5394—5402.[7]KriegAM,YiAK,MatsonS,eta1.CpGmotifsinbacterialDNA triggerdirectB—cellactivation[J].Nature1995,374:546-549.。
cpg序列的免疫激活机理及应用
CpG序列（CpG motifs）是DNA序列中的一种富含CpG二核苷酸的区域，其中CpG是胞嘧啶（Cytosine）和鸟嘌呤（Guanine）的组合。
在CpG序列中，CpG二核苷酸可以通过DNA甲基化来实现抑制。
然而，在免疫学领域，CpG序列的研究主要集中在其免疫激活的机制和应用上。
CpG序列的免疫激活机理：CpG序列可以模拟细菌和病毒的DNA，因为它们通常富含未甲基化的CpG二核苷酸。
这种模拟作用使得CpG序列能够通过与Toll样受体（TLR）和其他免疫细胞表面的受体结合，激活免疫系统，从而引发一系列的免疫反应。
具体而言，CpG DNA通过与TLR9结合，主要激活抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC），如树突状细胞（dendritic cells）和B淋巴细胞。
激活后，这些细胞会产生炎症介质，如干扰素（interferons）和细胞因子，进而激发自然免疫系统和获得性免疫系统。
此外，CpG DNA还能够促进B淋巴细胞的活化、分化和抗体产生。
CpG序列的应用：1.免疫疗法： CpG DNA被广泛应用于免疫疗法的研究和开发。
例如，CpGDNA可以作为免疫佐剂，用于增强疫苗的免疫原性。
它还被用于治疗某些癌症，通过激活免疫系统来抑制肿瘤的生长。
2.抗感染药物研发： CpG DNA的免疫激活特性使其成为治疗感染性疾病的潜在候选药物。
它可以增强机体对感染的免疫应答，帮助清除病原体。
3.免疫调节： CpG DNA可用于调节免疫系统的活性，有助于治疗一些免疫相关的疾病，如自身免疫病。
需要注意的是，虽然CpG DNA对免疫激活具有潜在的益处，但过度激活免疫系统可能导致免疫相关的副作用。
因此，在使用CpG DNA作为免疫治疗手段时，需要谨慎考虑剂量和治疗方案。
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递呈载体纳米化处理使得纳米粒具有无免疫原
性 、细 胞毒性 ；有 较高 的基 因转 染效率 ，可 获得靶 基 因 的长期稳 定表 达 ；可保 护药 物或靶 基 因不受 机 体血 浆 或组织 细胞 中多 种酶类 和 补体 的破坏 。武 梅
转染载体包裹 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ ｐ — Ｎ ，可提高转染效率”。 ３ 藻酸 盐微 粒 藻酸盐是一种生物可降解材料 ，在特定条件或
放包 裹 的抗原 ，减 少给 药次数 ，获 得长期 的免 疫效 果 ，更能 有效 地经胞 吞作 用进 入 到鼻相关 淋 巴组织 （ Ｌ） ＭＡ Ｔ ，诱 导机 体 的黏膜 免 疫应 答 ，可 以成 为很 好 的 黏膜 疫 苗 制剂 。Ｆｒ ｉ ｅｒ ｒ 利用 藻 酸 盐 和多 聚 ｅ ｏ等 赖 氨 酸制 成 的嵌 段 聚合 物 作 为 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的 载体 ， ｐ— Ｎ
．
、
免疫佐剂 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的发现源于早期人们对癌 ｐ— Ｎ
２ 脂 质体 和脂 质体 复合物
．－ － －
症治疗的探究。研究 已证实 ，Ｃ Ｇ Ｄ Ａ作为多种 ｐ— Ｎ
抗 原 的佐 剂 ，表 现 出独 特 的免疫 增强 作用 ，其 可 以
脂质体作为递呈载体是临床应用较早且发展最 为 成熟 的一类 新 型靶 向制剂 ，具 有无毒 、无 免疫 原 性 、可生物降解等特点 。脂质体及其脂质体复合物 作 为 Ｄ Ａ载 体 ，可 以有 效 提 高免 疫佐 剂 Ｃ Ｇ Ｎ ｐ— Ｄ Ａ 的生 物 活性 ，增强 Ａ Ｃ 的吞噬效 应 ，提高 其 Ｎ Ｐｓ 抗原提呈效率和能力 ；延长体 内停 留时间 ，形成 仓库效应 ； 减少佐剂 、疫苗使用量、降低毒副作用 等 ］ ａｆ ｉ 。Ｊａ ｒ等采用水合脱水法将 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ和利 ａ ｐ— Ｎ 什 曼原 虫抗 原 （ ｐ ３ 包裹 于脂 质体 中 ，并 免 疫 ｒ ６） ｇ Ｂ Ｌ ／ 小 鼠，攻毒试验表明 ，脂质体包裹组能够 Ａ Ｂｃ 产 生 很 好 的 免 疫保 护 力 ，提 高 ＩＧ ａ ｇ ｇ ２／ Ｇ１和诱 导 Ｉ
等 也 成 功 地 采 用 壳 聚 糖 纳 米 颗 粒 （Ｎ ） 裹 Ｃ Ｇ Ｃ 解产物对机体 不产 生 毒副 作用 。当其 作为 免疫 佐剂 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ 的 ｐ— Ｎ 载体运送入机体 ，可有效避免核酸酶降解 ，促进抗 原 和佐剂 的共 递呈 ，并 且通过 聚合 物 的降解缓 慢 释
布具 有很 高 的靶 向性 ，且与 免疫 的途径 具有 一定 的
水平 ，从而 降低 了 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ免疫 刺激活性 。因 ｐ— Ｎ 此 ，药 物载体 递呈 技术 的应 用 ，不仅 能够解 决体 内
降解 的 问题 ，而且 还能 有效 提 高 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的免疫 ｐ－ Ｎ 刺 激活 性 。这对 于有效 增强 机体 的免疫 效应 、降低 刺 激性 、较快 产 生抗体 以及刺 激 细胞 免疫 具有重 要 意义。
１ 纳 米载体
相关性ｎ。孙瑞林等在探讨多聚胺胆 固醇阳离子脂 ” 质体（ Ｃ ） Ｃ Ｇ Ｄ Ａ复合物对哮喘小 鼠肺组织 ＰＬ与 ｐ— Ｎ
嗜 酸性 粒 细胞 （ Ｏ ） Ｌ Ｓ 的影 响 中发 现 ，Ｐ Ｌ雾化 介 导 Ｃ 可 以 减轻 以 Ｅ Ｓ为特 征 的炎症 反 应 ，利 用 Ｐ Ｌ为 Ｏ Ｃ
自然 条件 下能 够被 化学试 剂 、微生 物或 酶降解 的材
等对纳米粒径 的 Ｐ Ｇ和脂质体作为包装分子包裹 Ｌ
含 Ｃ Ｇ序列 的 ｐ Ｃ ８质粒 对 猪 副伤 寒 疫 苗 的免疫 ｐ Ｕ １ 增效 进行 了比较 ，结果 显示 ，其免 疫增 强效 果 同脂 质体 包 裹后 的免 疫佐 剂效 应 相似 或更 强 。向一 等 采用 壳 聚糖 纳米 粒 包裹 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ联 合重 组 乙肝疫 ｐ— Ｎ 苗具 有 增强 免疫 抑制 小鼠 的免疫 应答 能 力 。彭 蓉
不 足 的缺 陷 ，通 过模拟 感染 过程 诱导 强烈 的免疫 应
答…。然而 Ｃ Ｇ￣Ｎ ｐ － Ａ的体 内清除和有效递呈却 Ｄ 在很大程度上限制 了其免疫学应用。特别是 Ａ Ｃ Ｐｓ
细 胞对 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的结 合 与摄 取是 诱 发免 疫应 答 的 ｐ— Ｎ
首要环节 ，而 由于受到 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ半衰期较短和体 ｐ— Ｎ
产 生 高水 平 的 ＩＮ ｇ Ｆ — 。Ｗｉｏ ｌ ｎ等人 用 脂质体 纳米 ｓ 包 裹 Ｃ ＧＯ Ｎ后 不 同途径 免 疫 ＩＲ小 鼠后 观 察 其 ｐ Ｄ Ｃ
刺激机体对免疫原产生较早 、较强 、 较持久 的免疫 应答。此外 ，Ｃ Ｇ Ｄ Ａ经鼻腔 、口腔 、直肠等途 ｐ— Ｎ 径 免疫 接种 后 ，具有 明显 的黏膜 佐剂 的效 应 ；而作 为新型疫苗的佐剂 ，其能够克服新型疫苗 中Ｐ Ｍ Ａ Ｐ
内核 酸酶 降解 的 限制 ，往 往使 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ在 以一 定 ｐ— Ｎ
免疫途径进入机体后 ，很快便被核酸酶降解 吸收进
人循 环 系统 ，细胞 的有 效摄 取率 根本无 法 达到 阈值
免疫增效作用 ，结果发现 ， 脂质体不仅能够显著提 高 Ａ Ｃ 对 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的吞噬 ，节约佐剂用量 ，提 Ｐｓ ｐ —Ｎ 一 高机体的体液免疫和细胞免疫 ；同时 ，其药代动力 学研究结果表明 ， 包裹后的 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的转运和分 ｐ— Ｎ
Ｏ Ｎ，并发 现 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ具 有 高效诱 导 小 鼠对 乙肝 Ｄ ｐ— Ｎ 疫苗 的体 液免 疫应答 和 细胞免 疫应 答 ，减 少佐 剂用 量 。Ｊｓｐ ｏｅｈ等 以 纳米 粒 脂质 体 包 裹 Ｃ Ｇ Ｎ ｐ —Ｄ Ａ， 也可 以诱导机 体较 强 的免疫应 答 反应 ，且共 度试验
可 以保 护 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ在 机 体 内 不被 降解 ，提 高 ｐ— Ｎ Ｃ Ｇ Ｄ Ａ的稳定性 ，从而保证其免疫刺激活性 的 ｐ— Ｎ 正常发挥 。Ｔ ｆ ｈｄ 等利用藻酸盐包封破伤风内 ａ ｇｏｉ ａ 毒素 （Ｔ 和 Ｃ Ｇ Ｄ Ａ两种物质通过鼻免疫患 白化 Ｔ ） ｐ —Ｎ