流式细胞仪原理及软件介绍
流式细胞仪的原理和应用
流式细胞仪的原理和应用1. 引言流式细胞仪是一种常用于细胞分析和分选的实验室仪器。
它通过光学技术和流体力学原理，能够快速、准确地测量和分析细胞的各种参数。
本文将介绍流式细胞仪的原理和应用。
2. 原理流式细胞仪的工作原理主要包括以下几个部分：2.1 光学系统流式细胞仪通过激光束照射待测细胞，细胞内的荧光标记物被激发后会发出特定波长的荧光信号。
光学系统通过透镜、滤光片和光散射装置等光学元件，将细胞的荧光信号收集并转换为电信号。
2.2 流体力学系统流式细胞仪通过一个微细管道使细胞以单个细胞为单位通过检测区域。
流体力学系统通过控制细胞的流速和方向，确保细胞以适当的速度和位置通过激光束照射点，以确保准确的测量结果。
2.3 信号处理系统流式细胞仪的信号处理系统主要由放大器、模数转换器和计算机组成。
放大器将收集到的电信号放大到适当的范围，并将其转换为数字信号。
模数转换器将数字信号转换为计算机可以处理的数据，计算机则对这些数据进行分析和图像处理。
3. 应用流式细胞仪广泛应用于生物医学领域，常用于以下几个方面：3.1 免疫表型分析流式细胞仪可以通过检测细胞表面的特定标记物，如细胞膜上的抗原或细胞内的特定蛋白，来对细胞进行免疫表型分析。
这对于研究免疫系统、识别疾病标记物以及血液分析等应用具有重要意义。
3.2 细胞周期和凋亡分析流式细胞仪可以通过检测DNA含量的变化来研究细胞的分裂周期和凋亡过程。
这对于了解细胞生命周期、细胞增殖以及细胞死亡机制等方面的研究非常有帮助。
3.3 细胞分选与单细胞分析流式细胞仪还可以根据细胞的荧光信号和其他参数，对细胞进行分选。
通过设定合适的阈值，可以分别收集到不同亚群的细胞，从而进行后续的单细胞分析和研究。
3.4 体外受精和胚胎筛选流式细胞仪可以对体外受精过程中的精子和卵子进行分析和筛选，从而提高体外受精的成功率。
此外，对于胚胎的筛选和评估也可以使用流式细胞仪进行。
3.5 微生物学研究流式细胞仪对微生物的研究也具有重要意义。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对单个细胞进行快速、高效的分析和排序。
流式细胞仪的工作原理是利用激光照射细胞，测量细胞在流动状态下的荧光和散射信号，从而获取细胞的多种特征信息。
本文将详细介绍流式细胞仪的工作原理，以及其在生物医学研究中的应用。
首先，流式细胞仪的工作原理基于细胞在流动状态下对激光的反射和荧光发射。
当细胞悬浮在流体中通过激光束时，细胞会散射激光光线并发出荧光信号。
流式细胞仪通过收集这些散射光和荧光光信号，并对其进行检测和分析，从而获得细胞的多种信息，如大小、形状、表面标记物、细胞器的含量等。
其次，流式细胞仪的核心部件包括激光系统、光学系统、流体系统和信号检测系统。
激光系统用于产生激光束，不同波长的激光可用于激发不同荧光染料；光学系统用于聚焦激光束和收集散射光和荧光光信号；流体系统用于将细胞悬浮液以单个细胞的方式输送到激光束中；信号检测系统则用于检测和记录细胞发射的光信号。
这些部件协同工作，使得流式细胞仪能够高效地对细胞进行分析和排序。
流式细胞仪在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于表征和分析不同类型的细胞。
通过对细胞的大小、形状、表面标记物等特征进行分析，可以帮助科研人员更好地了解细胞的功能和特性。
其次，流式细胞仪还可以用于细胞的分选和分离。
科研人员可以根据细胞的特征，利用流式细胞仪将不同类型的细胞进行分选和分离，从而获得纯度较高的细胞群。
此外，流式细胞仪还可以用于检测和分析细胞内的蛋白质、核酸和其他生物分子，对于疾病诊断、药物筛选等方面有着重要的应用价值。
总之，流式细胞仪通过激光照射细胞，测量细胞在流动状态下的荧光和散射信号，从而获取细胞的多种特征信息。
它在生物医学研究中有着广泛的应用，可以帮助科研人员更好地了解细胞的特性，进行细胞的分选和分离，以及分析细胞内的生物分子。
随着技术的不断进步，流式细胞仪将在生物医学研究领域发挥越来越重要的作用。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪是一种用于细胞分析的高效、准确且灵活的仪器。
它主要通过光学原理和流体力学原理来实现对细胞的分析和计数。
具体来说，流式细胞仪的工作原理如下：
1. 光学系统：流式细胞仪通过激光器产生一束单色、相干、高强度的光束，常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器等。
该光束经过特殊的光学透镜系统聚焦成一个细小的光点。
2. 将细胞样品注入流式细胞仪：样品一般为细胞悬液，可通过注射器或管道将其引入流式细胞仪。
为了保持细胞在单一层面通过光束，样品会与缓冲液混合并通过一个细管。
3. 流动系统：样品通过流动系统以一定的速度从流式细胞仪中流过。
流速可根据需要调节，通常为每秒几百到几千个细胞。
4. 切割和激发：当流过的细胞出现在光束中时，光束被活化和切割成小块，使每个细胞都接收到光的作用。
激发光束的颜色和波长取决于所使用的荧光探针。
5. 检测系统：流式细胞仪中的探测器可以检测细胞对光的散射和荧光。
流经的细胞会散射光，通过散射光的强度和角度测量可以获取细胞的大小、形态和复杂性等信息。
另外，如果细胞标记了荧光染料，探测器还可以检测荧光信号的强度和颜色。
6. 数据分析：流式细胞仪通过计算机对检测到的荧光和散射信号进行处理和分析。
可以对细胞进行计数、分类和排序，并生成各种图表和图像来描述细胞的特征和分布。
通过以上步骤，流式细胞仪可以快速、准确地分析细胞的各种参数，如大小、形态、表面标记物的表达水平以及细胞在特定条件下的生存率等，从而提供宝贵的细胞学数据。
流式细胞仪的原理介绍
流式细胞仪的原理介绍流式细胞仪是一种广泛应用于生命科学领域、可进行单细胞分析的高精度仪器。
它可以对单个细胞进行多维度分析，包括细胞大小、形状、荧光强度等，是生命科学研究、临床诊断和药物筛选等领域不可或缺的工具之一。
原理流式细胞仪通过光学聚焦将流动液体中的单个细胞定位到激光束上，并测量细胞中所含的受检分子或结构标记物的荧光强度。
其原理是将液态的细胞悬浮液加速成一个均匀的单层细胞流，使得单个细胞经过激光光源后，荧光标记分子的信号经过适当的荧光滤波器后被光电二极管捕捉，从而得到细胞的不同参数信息。
流式细胞仪中，主要采用激光技术对细胞进行照射。
激光出光点经过透镜系统聚焦，成为亚微米的强光束，对悬浮的细胞来说是一个瞬时的照射。
细胞内的荧光染料吸收激光光子后发生荧光，其激发光源和荧光特性由荧光分子的光学特性、不同的波长和能量组成。
根据荧光的特点，可以进行多维度分析。
在流式细胞仪中，每个细胞都被分为单个事件，并被分配到不同的数据集中。
通过检测单个细胞的光信号，可以获取细胞的荧光信号和散射信号，从而得到细胞在不同参数下的数据信息。
这些参数可以是细胞的大小、形状、荧光强度、荧光波长等。
应用领域由于流式细胞仪可以对单个细胞进行多维度分析，因此其应用广泛，包括以下几个方面：生物医学研究在纯化和检测过程中对细胞早期检测十分关键，以便提高疗效并防止患者进展到生命威胁状态，因此流式细胞仪在癌症、免疫学、细胞生物学等方面可以广泛应用。
临床药物筛选流式细胞仪可用于药物筛选和药效研究。
它可以监测药物影响细胞功能的能力和药物的毒性，以及在治疗期间细胞反应的变化。
生命科学教学流式细胞仪可以为生命科学教学提供高效的实验手段，通过新学期细胞之间互相影响及不同样品的细胞文化，深入了解细胞分子结构和复杂的细胞网络。
总结流式细胞仪通过光学聚焦将流动液体中的单个细胞定位到激光束上，并测量细胞中所含的受检分子或结构标记物的荧光强度。
其应用领域广泛，包括生物医学研究、临床药物筛选和生命科学教学等。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对细胞进行快速、高效、准确的分析和排序。
流式细胞仪的工作原理基于光学和流体力学原理，下面将详细介绍其工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统包括激光器、光学透镜、滤光片和光电探测器等。
激光器产生高能量的单色光束，常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等。
光学透镜用于聚焦激光束，使其能够准确地照射到待测样品上。
滤光片用于选择特定波长的光线，以便对不同的细胞成份进行分析。
光电探测器用于接收样品中散射或者荧光产生的光信号，并将其转化为电信号。
2. 流体力学系统流式细胞仪的流体力学系统主要包括进样系统、流动装置和排样系统。
进样系统用于将待测样品引入流式细胞仪中，通常通过吸管或者自动进样器实现。
流动装置通过施加适当的压力，将样品推动至流动池中，并保持样品在流动池中形成单个细胞的流动状态。
排样系统用于将已经分析过的样品排出流式细胞仪。
3. 细胞分析当样品进入流动池后，激光束照射到细胞上，细胞会发生散射和荧光现象。
流式细胞仪通过光电探测器接收细胞产生的散射光和荧光光，并将其转化为电信号。
根据细胞的大小、形状、颜色和荧光强度等特征，流式细胞仪可以对细胞进行分类和分析。
4. 数据分析流式细胞仪将采集到的电信号转化为数字信号，并通过计算机进行处理和分析。
计算机软件可以根据用户的需求，对细胞进行分类、计数和定量分析。
用户可以根据细胞的特征，绘制散点图、直方图、柱状图等图形，以便更直观地观察和分析细胞的特征。
总结：流式细胞仪的工作原理是基于光学和流体力学原理。
通过激光器产生的光束照射到细胞上，细胞会发生散射和荧光现象。
光电探测器接收细胞产生的光信号，并将其转化为电信号。
流体力学系统实现了样品的进样、流动和排样。
计算机软件对采集到的数据进行处理和分析，以便用户对细胞进行分类和定量分析。
流式细胞仪的工作原理使其成为生物医学研究中不可或者缺的工具，可广泛应用于细胞学、免疫学、生物化学等领域。
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滤片
带通滤片 BAND PASS (BP)
只允许某些波长的光通过
630 nm BandPass Filter
White Light Source
Transmitted Light
二向色性滤片 DICHROIC FILTER
620 -640 nm Light
一定波长以上通过，该波长以下折射
Beckman Coulter Celllab Family
EPICS XL-ADC
QUANTA SC
Gallios/Navios MoFlo XDP
Cytomics FC500
Cyan ADP
FC500硬件
What is flow cytometry?
流式细胞术是单个细 胞/颗粒流过检测装置 过程中，检测到的物 理和/或化学的特性。 Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition
90LS Sensor
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
1000
Scale
1000 200 50 40 20 15 8
200 400
600
100
30
Monocytes Lymphocytes
0
0 200 400 600 800 1000
90 Degree Scatter
Forward Scatter Projection
Neutrophils
Forw ard Scatter
800
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会 有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射 波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些 光学信号
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
光路 - 滤片特性
A/D转换
分析系统：计算机
流路构造
流
路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细 胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及软件介绍
Beckman Coulter流式细胞仪发展史
1947年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析 1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动 补偿和脱机补偿时代 2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级 为FC500/MPL 2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞 分析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出 MPL进样系统 2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的 领导者 2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios
分类
分析型：只能分析用，液流进入废液筒 分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管 道绝对无菌。
基本原理
流路（液流系统）
流动室
鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路（光学系统）
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）
放大电路HV及GAIN 增益
常用激光器及其通道分配表
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小
620
675 620 755 670
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
APC
633Βιβλιοθήκη 6705 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
荧光染料比较(平均荧光强度)
Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统
CD8-FITC
光路构造
光
光源
路
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片
光
路
光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光
空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列
Single
Parameter Histogram: Count vs MFI
Immunophenotyping
15
Count
11
7
3
0
0
0
0
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
Single Parameter Histogram
Dual Parameter Histograms
Dual Parameter Histograms
前向散射光
Laser
FALS Sensor
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光
SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称 为90度散射光检测器
SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比
侧向散射光
Laser
FALS Sensor
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING)
•发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) 488 488 525 575
用途
免疫荧光 免疫荧光
颜色
绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP
488
488 488 488 488
分析系统
以FC500机型的CXP软件介绍
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg
Light Source
Transmitted Light
Reflected light
Optics - Detectors
Photomultiplier tube (PMT)
将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号
不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程
长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过
短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过
光路 - 滤片特性
当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波 长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光
这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)