淋巴细胞功能检测
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
淋巴细胞亚群检测意义
淋巴细胞亚群检测意义
淋巴细胞亚群检测的临床意义是了解恶性肿瘤、免疫缺陷病、血液病等。
淋巴细胞亚群检测是检测机体细胞免疫功能的重要指标，它能反映机体当前的免疫状态、功能和平衡情况，可以辅助诊断多种疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病等，同时可分析其发病机制，对于观察临床治疗效果和预后具有重要的意义，淋巴细胞亚群检测时CD4⁺淋巴细胞减少CD4绝对值的变化可用于艾滋病的免疫状态分析、疗效观察及预后判断。
可见于恶性肿瘤、免疫缺陷病比如艾滋病、血液病比如再生障碍性贫血等。
在检查前一天，患者饮食以清淡，以消化为主，同时要忌烟酒，晚上10点以后进食，可适当饮用温开水，次日早上空腹检查，如果检查后患有疾病要积极配合医生进行治疗，防止病情加重。
免疫学实验——淋巴细胞功能检测
材料: 1.肝素(100单位/毫升)、 淋巴细胞分层液人 的正常血液 2.0.5%绵羊红细胞悬液(用Hanks液配制), Hanks 液 3.吸收过的胎牛血清:取经56℃30分钟加热灭 活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟， 取上清液即成。 4. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
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B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
原理：ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验，可用于测定产 生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后 加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的 抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代 表一个产生抗体的细胞。
方法
1.抗原包被: 37C° 2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯 平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2.抗体生成细胞培育:加入适量抗体生成细胞，37C°, 5%CO. ，3~4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3.测定斑点产生细胞:加二抗，37C° ，5%CO.2，2~3h。加辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4计数: 24h后用10~30倍显微镜下计数斑点形成细胞。
淋巴细胞功能检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之(从影响淋巴细胞功能、
T淋巴细胞增殖的角度考虑) .
淋巴细胞功能检测
•T细胞增殖（转化）实验 •绵羊红细胞玫瑰花环试验 •B细胞产生抗体能力的测定 •细胞因子的检测
T细胞增殖（转化）实验
原理：T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在 24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如 细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由 淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞 转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
淋巴细胞标志和功能的检测
淋巴细胞标志和功能的检测人体内的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。
临床上各种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化。
因此计数外周血和组织内淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。
第一节T细胞表面标志的检测一、特异性抗原的检测检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。
自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。
常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如表21-1所示。
表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特异性用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。
两类方法各有优缺点。
以下叙述有代表性的方法。
（一）间接免疫荧光法本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。
如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。
（二）免疫细胞化学法通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。
为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。
该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。
项目十七 T淋巴细胞表面标志和功能检测
项目十七T淋巴细胞表面标志和功能检测一、E花环形成试验(Erythrocyte rosette formation assay)【实验原理】人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，可与SRBC结合形成花环样细胞团(即E花环)。
此试验用于计数T细胞数量，进而可判断机体细胞免疫状况。
由于T 细胞的异质性，其中在4℃放置1h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et 花环)，而淋巴细胞与SRBC混合后不经4℃作用，立即反应形成的花环称为活性花环(Ea花环)。
【试剂和器材】1．肝素抗凝剂用Hanks液将肝素配成500U/ml，分装，每管0.1ml，置4℃备用。
2．淋巴细胞分离液(密度为1.077±0.001)。
3．小牛血清56℃加热灭活30min，按2:1比例与沉积SRBC混合，置37℃30min，离心，收集血清备用。
4．0.5％SRBC悬液取脱纤维或Alsever液保存的羊血，用5～10倍量生理盐水洗3 次。
第3次2500r/min离心10min，弃上清液，用生理盐水配成0.5％的SRBC悬液(约108个细胞/ml)。
5．0.8％戊二醛取30.25ml 4.5 g/L NaCl 盐水，加入1ml 25％戊二醛即可。
6．姬姆萨-瑞氏染液取磷酸缓冲液(PB：1/15 mol/L, pH7.0～7.4)10ml，加入姬姆萨染液6滴及瑞氏染液1滴。
7．Alsever液、Hanks液(无Ca2+和Mg2+, pH7.2～7.4)、PB(1/15 mol/L, pH7.0～7.4)、生理盐水。
8．离心机、水浴箱、电冰箱、显微镜、离心管、载玻片、盖玻片、吸管、吸球、注射器。
【步骤和方法】1．淋巴细胞悬液的制备取2ml肝素抗凝血，加入2ml Hanks液，叠加于2ml 淋巴细胞分离液上，水平离心2000 r/min 20 min。
取出单个核细胞层，用4~5倍Hanks液洗2次，每次离心1000r/min 10min。
淋巴细胞亚群检测意义
淋巴细胞亚群检测意义淋巴细胞是人体免疫系统中的重要组成部分，分为T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等多个亚群。
对于淋巴细胞亚群进行检测有助于了解个体的免疫状态和疾病风险，对于指导临床诊断和治疗具有重要意义。
1. 淋巴细胞亚群的分类及功能1.1 T细胞T细胞是淋巴细胞家族中的一类重要细胞，主要包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。
CD4+T细胞在机体中发挥着调节免疫应答、促进B细胞产生抗体和激活细胞毒性T细胞的作用；CD8+T细胞则具有直接杀伤感染细胞的能力。
1.2 B细胞B细胞是一类产生抗体的淋巴细胞，主要作用是识别和清除体内的病原体，参与体液免疫应答。
1.3 自然杀伤细胞自然杀伤细胞是一种非特异性杀伤肿瘤细胞和感染细胞的淋巴细胞亚群，对于清除体内异常细胞起着重要作用。
2. 淋巴细胞亚群检测方法淋巴细胞亚群检测可以通过流式细胞术、免疫组化、PCR等多种方法进行。
其中，流式细胞术是一种常用的检测方法，可定量分析不同亚群的细胞数量和比例。
3. 淋巴细胞亚群检测在临床中的意义3.1 评估免疫功能通过淋巴细胞亚群检测，可以评估个体的免疫功能状态，及时发现免疫功能异常，指导个性化治疗方案。
3.2 预测疾病进展某些疾病如艾滋病、自身免疫性疾病等会导致淋巴细胞亚群发生异常，检测这些变化可以帮助预测疾病的进展和预后。
3.3 指导药物治疗淋巴细胞亚群检测结果可为临床合理选药提供参考，比如在白细胞减少的患者中，可基于检测结果调整药物用量。
4. 结语淋巴细胞亚群检测在评估免疫功能、预测疾病进展和指导药物治疗等方面具有重要意义。
进一步深入研究淋巴细胞亚群的检测方法和临床应用，有助于提高疾病诊断与治疗水平。
淋巴细胞功能测定
免疫学技术原理与应用PAIT-12淋巴细胞功能测定孙汭中国科技大学生命科学学院免疫学研究所PMIT-12淋巴细胞功能测定一、常用的淋巴细胞功能测定二、T淋巴细胞功能测定三、B淋巴细胞功能测定四、NK细胞细胞毒试验一、常用的淋巴细胞功能测定1、淋巴细胞增殖试验① 3H-TdR掺入法原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。
此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。
② MTT比色法原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。
甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。
2、细胞毒试验①51Cr释放法原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。
然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。
51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。
即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。
（一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。
用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。
加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。
免疫T淋巴细胞检测——帮助了解你的免疫力
免疫T淋巴细胞检测——帮助了解你的免疫力免疫力是人体抵御疾病的重要依靠，而T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分。
T淋巴细胞检测是一种现代化的检测方法，可以帮助人们了解自己的免疫状态，有助于保持免疫系统的健康。
本文将向大家介绍免疫T淋巴细胞检测的相关知识，帮助大家正确认识自己的免疫力。
T淋巴细胞是什么？T淋巴细胞是一种白细胞，是免疫系统中的核心细胞之一，主要负责识别和攻击病原体、癌细胞等异物。
T淋巴细胞在人体免疫系统中起着重要作用。
它们通过产生特异性抗体、杀伤病原体和调节免疫反应等方式来保护身体免受疾病侵害。
T淋巴细胞的种类和数量各不相同，包括CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞等。
它们各自承担着不同的免疫功能。
例如，CD4+ T淋巴细胞主要负责指挥和调节免疫反应，激活其他免疫细胞，如B淋巴细胞和巨噬细胞等；CD8+ T淋巴细胞则是通过直接杀死病原体和癌细胞来保护身体免受侵害，T淋巴细胞数量过低可能意味着免疫系统出现了问题，进而导致身体容易感染疾病。
T淋巴细胞检测的作用是什么？1. 了解免疫系统的状况：T淋巴细胞检测可以帮助确定免疫系统的状况，包括T淋巴细胞的数量和比例。
通过了解自己的T淋巴细胞状态，可以判断免疫系统是否正常工作，是否存在免疫功能异常或免疫系统亢进的情况。
2. 预防和诊断疾病：T淋巴细胞检测可以帮助医生预防和诊断一些疾病。
例如，艾滋病、白血病等。
某些疾病会导致T淋巴细胞数量异常，通过检测T淋巴细胞的数量和比例，可以及早发现这些疾病的存在。
3. 判断免疫功能：T淋巴细胞检测可以帮助判断免疫功能的强弱。
免疫功能强的人，T淋巴细胞数量和比例通常在正常范围内。
而免疫功能较弱的人，会存在T淋巴细胞数量不足或功能异常的情况，容易导致感染和疾病的发生。
如何进行T淋巴细胞检测？1. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过样本细胞的荧光染色，使不同的T淋巴细胞呈现不同的颜色，然后采用流式细胞仪器进行检测的方法。
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（3）分子生物学测定法
用基因的技术检测细胞因子含量以及预测合成量
4、CKR 、CD、 AM 、表面受体的检测
检测方法目前大多采用间接荧光、 FCM 检查 其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。 上述分子除表达于细胞膜表面外，还以可 溶性形式存在于体液中。
二、示教：淋巴细胞转化
测定淋巴细胞功能的一种方法。 人类T、B淋巴细胞表面有丝裂原受体，T、B淋巴细胞能分 别与不同的丝裂原结合，发生淋巴细胞的转化增殖反应。
【实验材料】
一、实验动物（如balb/c小鼠）
二、注射器、针头、10ml离心管、滴管、试管、 玻片等常规实验仪器。
三、PHA、瑞氏姬姆萨染液，肝素，Hanks液等常 规实验试剂。
【作业】
验报告本，并将可行的实验内容在实 验课中实施。
一、讨论 （一）设计性方案要点
某些其他疾病时，转化率明显降低。
淋巴细胞的转化标准
方法：
提前三天给小鼠注射PHA0.5ml，6mg/kg ，一天一次， 连续三天。 剪断小鼠尾巴，向洁净载玻片上滴一滴血，用另一块洁 净的推片以450角推成血膜（头、体、尾分明）。
干燥后，瑞氏姬姆萨染色：滴3-5滴A液于载玻片1min， 6-10滴B液, 3min后充分水洗。 镜检，计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察玻片的头、 体、尾三段。每段各一纵列（以减少推片中细胞分布不 均的误差）。
实验动物分组
对照组、实验组处理因素干预
免疫功能检测指标确立 对照组、实验组机体免疫功能检测
实验方案
6W, 雌性 Balb/C 小鼠共 30 只， 静脉注射 环磷酰胺，每 3 天一次，共 4 次
香菇多糖组 10 只
广告产品组 10 只
PBS 组 10 只
2 周后，停止处理，改为给小鼠 肌注 PHA, 一天一次，共三天 取小鼠外周血，制备血涂片，瑞氏姬姆 萨染色，镜检计算淋巴细胞转化率
1-3h 绵羊红细胞 B
+ 补体 有丝分裂原
B 浆
浆
溶 血 空 斑 实 验
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
① 稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞
3、细胞因子的检测
细胞因子的检测有助于了解该细胞因子在免疫调节 中的作用，以及鉴定分离提纯后的淋巴细胞的功能。 （1）免疫学检测法 以细胞因子为抗原的检测法 （2）生物学活性检测法 测定细胞因子相关的生物学活性
T细胞转化、增殖试验:H3-TdR掺入
T PHA ConA 母 测转化率 增殖
加H3-TdR
T
T
T
测掺入量
T细胞毒性试验
CTL
+
靶
-51Cr
靶细胞溶解， 51Cr释放 测放射活性
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
淋巴细胞功能的体内试验
结 核 菌 素 反 应
2、B细胞功能测定 溶血空斑试验
B
+ 温育
（二）淋巴细胞功能检测的主要内容
T细胞功能测定
B细胞功能测定
单核巨噬细胞、NK细胞等功能测定
细胞因子的检测
CD分子、表面受体、粘附分子的检测
1、T细胞功能测定
（1）T细胞转化、增殖试验 ① H3-TdR掺入 ②细胞能量代谢测定（ MTT检测法） ③形态学计数 （2）迟发性超敏反应的检测 （3）T细胞分泌功能的检测 （4）流式细胞仪对T细胞功能的检测 （5）T细胞介导的细胞毒试验
免疫学检测的临床应用（回顾）
认识、阐明相关疾病发病机制 诊断、辅助诊断相关疾病 免疫功能检测与监视
实验四 设计性实验：常见细胞免疫检测II
【实验任务】
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一 个方案证实之（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的 角度考虑）。
【目的要求】
一、学会设计实验，从淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角 度证实某产品有免疫增强作用。 二、掌握淋巴细胞转化试验的原理及临床实用价值。
根据淋巴细胞转化率，可以间接判断机体免疫状态。
三、操作：淋巴细胞转化试验
（一）原理：
T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异丝裂原（PHA、 PWM和ConA）刺激均能使细胞发生形态改变而转化为 淋巴母细胞。 T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平， 常被作为细胞免疫功能指标之一。 计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡 型、母细胞和分裂相淋巴细胞。 细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或
48~72 h
【思考题】
检测T、B淋巴细胞功能的实验主要有哪些？ 淋巴细胞转化试验有何临床实用意义?
影响淋巴细胞转化试验的因素有哪些?
How to make blood smears
血涂片质量评价
头体尾 分明 厚薄均匀 长度 适中
推片
计算
转化淋巴细胞数 淋巴细胞转化率＝ 100 ％ 转化淋巴细胞数＋未转 化淋巴细胞数
一般认为转化率的正常值为60～70%
结果与结果分析
PHA
ConA 增殖 母 细胞因子
T
T T
T
PHA