高通量测序及个体化医学课件

? MDA（不以PCR为基础的扩增技术）是目前公认的最好 的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的 均匀扩增，扩增出10~100kb大小的片段，能提供大量均 一完整的全基因组序列。但是MDA也有一些缺点，特别是 显著的非特异扩增，往往空白对照样品也总是“无中生有” 地产生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏差。另外， 对测序得到 的大量数据结果的专业分析也是一个重大的 挑战。单细胞全基因组测序正在从基础研究走向临床应用。
? 同时大规模存储并分析基因数据，对相应大数据的把握、获取、分析， 应用大数据可用于构建预测癌症、提高诊断精度以及能够反映疗效的 模型，从而打通从基因组数据到临床应用的道路，发现基因突变和疾 病的关系。
? 基因数据的另一个重要用途就是预测健康风险。能够预测个体感染某 种疾病的可能性并进行个性化的治疗和药物选择，以便获得最大化的 疗效，并最大程度上减少不良反应；还能够用来预测和确定遗传疾病， 通过详细的了解个体的基因情况，确定遗传变异导致个体患某种遗传 疾病的可能性。在不久的将来，当数据库足够大时，我们就可以用它 作为参照，来推断所有人的健康风险，不论他之前是否参：
? 传统药物治疗对于病人通常是对症下药，千篇一律。依赖靶向药物等 技术进行的精准治疗，就是以大数据分析结果作为参考，根据患者的 基因和所处的环境来为其定制个性化治疗方案的过程，即在合适的时 间，给合适的患者，进行合适的治疗。“精准医疗”计划的目标是更 好地了解人类疾病的致病机理，并根据个人基因组特点靶向用药。
高通量测序及个体化医学
测序
? 测序是指通过专业的分析工具测定物种细胞内DNA或RNA碱基排序 的过程。根据方法的不同，目前测序主要分为Sanger法测序和高通量 测序。
? Sanger法测序又称为一代测序，该方法利用一种特定的DNA聚合酶 来延伸结合在待定序列模板上的引物，通过掺入一种链终止核苷酸来 完成测序。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含 有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入有限量的不同碱基类型 的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基 团，从而使延长的寡聚核苷酸选择性地终止延伸，终止点由反应中相 应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使 反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始 点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离 大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标 记进行检测。
单细胞全基因组测序
2014年1月《自然—方法学》（Nature Methods）上发表年 度特别报道，将“单细胞测序”（Singled out for sequencing）的应用列为2013年度最重要的方法学进展。
单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩 增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量 全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后 通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细 胞进化关系。它解决了用组织样本测序时或样本少无法解决 的细胞异质性难题。为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、 发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的 研究方向。
第一步 基因检测
? 从人类发现DNA的双螺旋结构，第一次窥探了生命体如 何继承和储存生物信息，到“人类基因组计划”宣布完成， 再到高通量测序技术的出现，正逐渐开启“个人基因组”的 时代。个人基因组学是实现“精准医疗”的一把利器，而“精 准医疗计划”首先就是要完成一百万人的基因组测序。癌 症是基因组疾病，每个肿瘤都有自己独特的基因图谱。精 准医疗就是通过检测癌症患者的基因信息，利用DNA测序 技术确认导致患者患病的基因或者受检者是否携带有肿瘤 易感基因，来诊断或治疗患者的疾病。针对每位患者的基 因图谱，了解癌细胞内的遗传改变，从而选择更有效的治 疗癌症的方式。高通量测序具有较高的精度以及可准确诊 断病患基因个体化差异，基因检测技术则在精度上更为准 确，可测通量更多，使得基因测序不仅是一种优秀的分子 诊断方法，而且是目前最适宜的个体化诊断方式。
个体化医疗
? 传统的循证医学是结合临床医生的个人实践经验 和客观的科学研究证据，对于症状相同的病人使 用相同剂量的同种药物进行治疗，但治疗效果却 千差万别。传统治疗方案显示，肿瘤的无效率高 达75%，糖尿病无效率 43%，抑郁症无效率也有 38%。人们逐渐意识到大多数疾病的发生是自身 遗传密码和外界环境共同作用的结果。 精准医疗 借助可监测的遗传信息和环境信息，针对个体提 供定制的优化治疗方案，提升现有治疗水平，并 尽量在发病前就有望有效预防。
第二步 建立基因数据库
? 首先，建立一个整合肿瘤遗传信息与肿瘤疗效数据的信息平台，建立 一个对科学家和临床医生同样适用的分子信息和临床知识整合系统。 这一知识体系将包括遗传学、生物化学、环境和病人临床信息等各方 面的数据，对数据库中各种混合数据进行有效的整合，建立信息平台 支持应对肿瘤治疗的基因数据信息，开展更先进合理的生物信息学研 究来满足海量数据的分析要求。
? 全基因组扩增技术主要分为两种类型：
? 一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如简并寡核苷 酸引物PCR (DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (LMPCR)、扩增前引物延伸反应 (PEP)等；
? 二是基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如多重置 换扩增 (MDA) 和基于引物酶的全基因组扩增 (pWGA)。
? 高通量测序 高通量测序技术（ HighthroughputSequencing ）是对传统 Sanger测序 （称为一代测序技术）革命性的改变，由于该种 方法能够一次同时对几十万到几百万条核酸分子 进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代 或二代测序技术 (NextGenerationSequencing ， NGS)，足见其划时代的改变。同时，高通量测序 使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌 的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (DeepSequencing)