利用不同分子标记分析烟草种质资源多态性
基于分子标记的植物种质资源鉴定和利用
基于分子标记的植物种质资源鉴定和利用植物是人类的生命之源，它们为我们提供食物、药物、建筑材料和纤维等许多方面的资源。
随着人口的增加和环境的恶化，发展和利用高效的植物资源已成为一项非常重要的任务。
然而，要有效地利用植物资源，首先需要准确地鉴定和评价不同的植物种质资源，而分子标记技术正是一种非常有效的方法。
分子标记是指DNA的片段，它们在不同的个体之间存在着差异。
利用PCR技术，可以扩增出这些DNA片段，并通过测序、电泳或芯片等技术对它们进行分析和研究，从而对植物进行鉴定和分类。
基于分子标记技术的植物种质资源鉴定，具有很多优点。
首先，它可以准确地鉴定植物种质资源的遗传背景和亲缘关系，不受环境影响，避免了传统植物分类中存在的主观性和误差。
其次，通过基于分子标记的鉴定，可以快速地筛选出符合要求的优质品种，加速植物育种和遗传改良的进程。
最后，该技术还可以为探索植物进化和生态系统的演化提供有力的支持，为生物多样性保护和生态保护提供重要的科学依据。
然而，基于分子标记技术的植物种质资源鉴定也存在一些限制。
首先，该技术需要高端的实验设备和仪器，需要高端的技术水平和数据分析能力，成本相对较高。
其次，对于一些植物品种，尤其是野生品种和少利用品种，其基因组DNA难以提取和分离，难以进行分子标记分析。
此外，该技术还存在一定的误差率，数据可能受到环境和其它因素的影响，需要配合精细的研究设计和实验管理，才能获得可靠的鉴定结果。
尽管如此，基于分子标记的植物种质资源鉴定和利用，仍然是现代植物育种和保护生物多样性的重要手段，有着广泛的应用前景。
在实践中，可利用该技术进行不同品种之间的杂种检测、品种分类和亲缘关系研究；针对不同的植物部位和环境，可选择不同的分子标记技术，如RAPD、AFLP、SSR和SNP等；实施分子标记技术鉴定的同时，还可结合传统鉴定方法，互为参照，提高鉴定的准确性和可靠性。
基于分子标记的植物种质资源鉴定还有很多其他的应用，例如，可用于处理基因转化技术中的杂交子代检测和筛选，也可用于检测种子与种苗种类分辨和产品鉴定等方面。
应用IMP标记分析30份烟草品种的遗传关系
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(12): 2312−2319/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由云南省科技厅项目(2008CD194)和云南省烟草公司项目(08A05)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 卢秀萍, E-mail: xplu@, Tel: 0877-*******第一作者联系方式: E-mail: xiehe126@, Tel: 0877-*******Received(收稿日期): 2012-03-20; Accepted(接受日期): 2012-08-15; Published online(网络出版日期): 2012-10-08. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20121008.1256.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02312应用IMP标记分析30份烟草品种的遗传关系谢贺1高玉龙1宋中邦1桂毅杰2樊龙江2肖炳光1卢秀萍1,*1云南省烟草农业科学研究院, 云南玉溪 653100; 2浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310029摘要: MITE (miniature inverted repeat transposable element)是植物中存在的高重复的一类转座元件。
基于邻近MITE扩增多态设计的分子标记称为IMP标记(inter MITE polymorphisms)。
从133个IMP引物中筛选出32个稳定多态的引物, 并以30个烟草品种为材料, 获得185个多态条带, 平均每对引物检测多态条带5.78个。
聚类分析显示, 参试品种间遗传距离的变化范围为0.02~0.81、平均为0.33。
30份烟草品种可分为3类, 晒烟、香料烟、北方烤烟品种等属I类; 第II类主要是美国NC系列品种、Coker系列品种和中国云烟系列烤烟品种; 第III类为2个白肋烟品种。
利用SRAP分子标记分析种质资源 实验方案
利用SRAP分子标记分析种质资源1SRAP分子标记相关序列扩增多态性（SRAP）是由美国加州大学Li和Quiros于2001年发展的一种基于PCR反应的新型标记。
该技术是基于正向和反向引物对模板DNA的PCR扩增，引物具有3个明显不同的序列框(motif)：5’端存在的10-11个随机碱基序列，紧跟着CCGG（正向引物）或AATT（反向引物）的碱基序列，最后是位于3’端的3个选择性碱基。
从技术的可操作性来看，每个引物5’端的10个随机碱基序列可以促进任意序列的扩增，即类似于RAPD标记的结果。
正向引物的CCGG序列可以优先与具有丰富GC碱基的外显子序列退火结合，而反向引物的AATT序列可优先与具有丰富AT碱基的内含子和启动子序列退火结合，引物3’端的3个选择性碱基可以对模板DNA进行选择。
SRAP标记自开发以来，已在多种植物的遗传多样性分析、指纹图谱构建和物种亲缘关系分析研究等领域得到广泛应用。
该标记具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好，不需预知物种序列信息以及成本较低等优点，具有RAPD简单快捷之优点，同时还具有AFIP的稳定性和多态性，是简单又经济、有效又可靠的分子标记系统。
2.1 材料和试剂2.1.1 材料从各种中各随机选取5-15株个体采集叶片用于提取基因组DNA。
2.1.2 仪器与试剂研钵、冷冻高速离心机、水浴锅、紫外分光光度计、电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪液氮、离心管（1.5 mL、10mL）、PCR管、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒氯化钠、EDTA二钠盐、醋酸钠、Tris、CTAB、盐酸、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、冰醋酸、无水乙醇、PCR试剂、琼脂糖（1）2×CTAB提取液配制2×CTAB提取液终浓度母液5ml 10ml 15ml 20ml1.4 mMNaCl 5MNaCl 1.42.8 4.2 5.6 20mM EDTA 0.5M EDTA 0.2 0.4 0.6 0.8 100 mMTris-HCl (pH8.0) 1MTris-HCL, pH 8.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2% (w/v) CTAB 10% (w/v) CTAB 1.0 2.03.04.0 0.2% (v/v) β-mercaptoethanol β-mercaptoethanol 0.01 0.02 0.03 0.04 H2O H2O 1.89 3.785.67 7.56 （2）5 M NaCl（3）0.5 M EDTA-Na2（pH 8.0）（4）1MTris-HCL（pH 8.0）（5）10%(w/v)CTAB（6）0.2% (v/v) β-mercaptoethanol（7）氯仿、异戊醇混合液（24:1）（8）3MNaAc（9）TE：10mMTris-HCl，1mM EDTA, pH7.4（10）50×TAE电泳缓冲液（1L）：Tris 242g冰醋酸57.1 ml0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100 ml工作液为1×TAE（40mmol/L Tris-HAc, 1mmol/L EDTA）2.2 基因组DNA的提取(CTAB法)和检测采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：（1）取干燥叶片0.1g左右于研钵中，加液氮研磨成粉末，待液氮挥发完毕，将粉末迅速转移至离心管中；（2）加入65°C预热的3mL2×CTAB提取液，65 ºC水浴30 min，期间稍加混匀；（3）加入等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1，4mL），摇匀静止3min后室温离心10min （10000r·min-1）；（4）取上清液转移至新的离心管，用0.8 V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/ 0.1V3MNaAc沉淀DNA，-20℃下放置30 min以上；（5）4°C离心15min（12000r·min-1）；（6）弃上清，沉淀用70%预冷乙醇洗涤两次，自然风干，加适量TE溶解；（7）加RNase A至终浓度10 µg/ml，37 ºC消化30 min；（8）加等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1），翻转充分摇匀，室温离心10min（12000r·min-1）；（13）取上清液转移至1.5mL离心管，加入.8 V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/ 0.1V 3MNaAc沉淀DNA，轻轻翻转摇匀，-20°C冰箱过夜；（14）4°C离心15min（12000r·min-1），弃上清，70%预冷乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，并自然风干；（15）加入100μl TE 溶液，冷冻备用。
基于SSR分子标记的部分烤烟种质资源遗传多样性研究
基于SSR分子标记的部分烤烟种质资源遗传多样性研究1. 引言1.1 研究背景烟草是世界上重要的经济作物之一，而烟草的品质和产量受到遗传因素的影响。
烟草品质的提高和烟草新品种的培育需要对烟草种质资源的遗传多样性进行深入研究。
传统的遗传多样性分析方法存在着效率低、成本高以及信息有限的缺点。
利用SSR（Simple Sequence Repeat）分子标记技术对烤烟种质资源的遗传多样性进行研究具有重要意义。
SSR是一种微卫星DNA序列，具有高度可变性，是遗传研究中常用的分子标记。
通过SSR分子标记技术，可以快速准确地对烤烟种质资源进行遗传多样性分析，揭示不同品种之间的遗传关系和遗传变异。
利用SSR分子标记技术对烤烟种质资源的遗传多样性进行研究，有助于为烟草品质改良和新品种选育提供科学依据，促进烤烟产业的可持续发展。
本研究旨在利用SSR分子标记技术对部分烤烟种质资源的遗传多样性进行系统研究，为烟草遗传资源的保护与利用提供科学依据。
1.2 研究目的研究目的：通过基于SSR分子标记的方法，对烤烟种质资源的遗传多样性进行系统研究和分析，旨在揭示烤烟种质资源的遗传背景和遗传变异情况，为烤烟品种改良和新品种选育提供科学依据。
具体目的包括：1.探究烤烟种质资源的遗传多样性水平，分析其遗传结构和遗传距离，为种质资源的保护和利用提供理论基础；2.研究烤烟种质资源的遗传多样性分布规律，揭示其潜在遗传变异特点，为烤烟遗传改良及种质改进提供参考；3.探讨烤烟种质资源的遗传多样性对抗逆境胁迫的响应机制，为烤烟的抗逆性育种提供科学依据；4.总结烤烟种质资源的遗传多样性特点和利用潜力，为烤烟种质资源的有效保护、合理利用和可持续发展提供科学指导。
通过以上研究目的的实现，可以深入了解烤烟种质资源的遗传多样性特征，为保护和利用烤烟遗传资源提供科学参考和理论支撑。
1.3 研究意义烤烟是重要的经济作物之一，其遗传多样性的研究对于研究其遗传演化、育种和种质资源保护具有重要意义。
用ISSR标记构建烟草核心种质的指纹图谱
烟草传人我国已有 ２０多年 ， ０ 经过多种生态环 境条件的驯化和人工选择培养 ， 了许多种质资源。 有
从烟草的长远发展来说 ， 建立烟草核心种质 ， 并构建 核心种质 Ｄ Ａ指纹 图谱 ， Ｎ 为资源 的充分合理利用、
ｒｐａ ＩＳ ） ｅｅｔ。 Ｒ 是一 项基 于 Ｐ Ｒ 的 分子 标 记 技 术 ， Ｓ Ｃ 它 对 两个 序列 相 同但方 向相反 的微 卫 星重 复序 列 之 间
用 ＩＳ Ｓ Ｒ标 记 构 建 烟 草 核 心 种 质 的 指 纹 图 谱
聂 琼， 刘仁 祥 ， 梁 微
（ 贵州大学农 学院， 贵州 贵阳
５０２ ） ５ ０ ５
摘
要： 利用 ＩＳ ＳＲ分子标记对 ２ ３份烟草核心种质进 行分析。从 ３ ９个 ＩＳ Ｓ Ｒ引物中筛选 出 ８个 多态性 强的引物， 建 了２ 构 ３份烟草
种质 的 Ｉ Ｒ指纹 图谱 ， Ｓ Ｓ 共扩 增出 ｌ３ 多态性谱 带， １个 多态性 比率为 １ ０ ０％。Ｖ ｌ ６ Ｎ ８ 、 Ｃ ７ Ｆ Ｇ ４ ａ１ 、 Ｃ ２ Ｎ ２ Ｎ 、 １０等 １ ５个烟 草核心种 质有
特异分子标记 ， １个该特异引物就能将它们与其他核心种质相区分。从 ８个引物 中选择 ３— 用 ４个扩增谱 带加 以组合 ， 就能完全 区
代仪器分析技术基础 上发展起来 的， 进而可 以在遗 传育种 中对作物进行鉴定和质量控制。通过指纹 图 谱技术不但可 以达到烟草遗传育种及病虫防治的 目 的， 而且在判断品种稳定性及鉴别 真伪品种等方面
也 可 以得 到充 分利 用 ， 因此 ， 立烟 草种 质指 纹 图谱 建
靠 、 以 提 供 基 因 组 丰 富 信 息 的 Ｄ Ａ 指 纹 技 可 Ｎ 术 引。本文探 讨 了利 用 ＩＳ ＳＲ分 子标 记 建 立 烟 草
烟草ISSR-PCR反应体系优化的初实验
烟草ISSR-PCR反应体系优化的初实验覃剑峰;杨祥燕;彭欣怡;何江;王新钧;王东贤;王卫峰;陈涛;覃旭;崔明勇;黄显雅【摘要】为了探索建立烟草的ISSR-PCR最适反应体系,用单因素设计方法对影响ISSR-PCR反应体系的主要影响因素进行优化筛选.结果表明,烟草的最适反应体系为:反应总体积为20μL:2.00μL10×buffer,50ng(1μL)模板DNA,Taq聚合酶的用量为4U(0.8μL),0.6μmol/L(1.2μL)引物,0.75 mmol/L(0.6μL)Mg2+,0.3mmol/L(2.4μL)dNTP,dd H2O12μL,退火温度为52℃.用筛选的引物对36份烟草种质分别进行PCR扩增,扩增条带清晰,清晰度和多态性都较好,可以认为该反应体系对烟草种质具有较好的可靠性和稳定性.【期刊名称】《农业研究与应用》【年(卷),期】2018(031)003【总页数】4页(P19-22)【关键词】烟草;ISSR-PCR;优化体系【作者】覃剑峰;杨祥燕;彭欣怡;何江;王新钧;王东贤;王卫峰;陈涛;覃旭;崔明勇;黄显雅【作者单位】广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001;;中国烟草总公司广西壮族自治区公司烟叶处, 广西南宁 530001;中国烟草总公司广西壮族自治区公司烟叶处, 广西南宁 530001;中国烟草总公司广西壮族自治区公司烟叶处, 广西南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所, 广西南宁 530001【正文语种】中文烟草（Nicotiana tabacumL.）是茄科烟属的世界性经济作物，种植区域遍及全球[1]。
基于分子标记的种质资源鉴定与利用
基于分子标记的种质资源鉴定与利用随着全球气候变化和人口增加，农业领域的需求越来越高，而我们所处的地球也是越来越脆弱。
为了应对这些挑战，农业研究也在不断地发展。
其中，一项重要的研究领域就是种质资源鉴定与利用。
而基于分子标记的种质资源鉴定与利用，则是其中的重要子领域。
1. 种质资源鉴定种质资源是指用于研发新品种或者改良现有品种的，植物或动物种群所持有的遗传多样性。
种质资源的鉴定主要包括三个方面：种质资源的保护、标本及生理特性的描述统计和品质特性分析，而这些又可以进一步细分为分子水平和表型水平。
基于分子标记的种质资源鉴定主要是一种利用分子遗传学方法来研究和鉴定植物基因的分析技术，通过DNA、RNA分子等微生物技术手段，获得植物基因为基础的分子标记，以实现对植物遗传多样性的鉴定。
在实际操作中，基于分子标记的种质资源鉴定与利用技术可通过PCR（聚合酶链反应）技术和gel电泳等技术手段数据来进行分析，从而让我们能够更精确地对植物的遗传多样性进行分析。
2. 种质资源利用不同遗传类型的植物在种质资源互补上具有较高的差异性。
因此，对于基于分子标记的种质资源鉴定与利用技术来说，最主要的任务是分析种质资源之间的差异性，然后加以利用。
目前最常见的利用方式是植物育种。
而在育种中，这种利用方式主要分为以下三种：首先，我们通过分析植物遗传多样性，以识别与抗逆性相关的基因，为更好地抵抗气候变化和疫病的影响，进而推动了农业生产。
其次，基于分子标记的技术可用于筛选最适合地理条件的优秀植物品种。
这项工作必须在传统方法的基础上，利用分子标记对基因型进行优化，在该基础上评估植系统的适应性。
最后，利用分子标记技术，我们可以有效分析作物的基因组和其变异性信息，进而对作物的耐受性进行预测。
3. 总结总体来说，基于分子标记的种质资源鉴定与利用技术和其它技术相比，更具有精细和准确性。
有一些人认为，尽管我们在育种、种质资源管理和鉴别分析等方面的突破仍有限，但是这种简便且高效的基因标记技术已在作物遗传资源中得到普遍应用，可以帮助我们更好地管理和激发遗传多样性的利用。
我国烟草种质资源收集、鉴定及在育种上的应用
我国烟草种质资源收集、鉴定及在育种上的应用焦芳婵;吴兴富;陈学军;许美玲;李永平【摘要】种质资源是育种及农林业生产的重要物质基础.烟草新品种的选育及烟草产业的发展离不开种质资源的收集、深度挖掘及有效利用.为了解烟草种质资源在我国的发展状况,阐述了烟草种质资源国内外收集、保存的情况;介绍了烟草资源的分类、鉴定评价及种质创新等方面的研究进展;概述了近15年来烟草种质资源选育成新品种的应用现状.在此基础上,对目前种质资源系统评价、特异性状挖掘和创新利用潜力等方面进行了展望.%Germplasm resources are important material basis for breeding and agroforestry production. The breeding of new tobacco varieties and the development of tobacco industry rely on germplasm collection, deep excavation and effective utilization. To understand the development of tobacco germplasm resources in China, the collection and storage of tobacco germplasms at home and abroad were described. The classification, identification and germplasm innovation of tobacco resources were introduced, and the application of new varieties bred from tobacco germplasm resources during the past 15 years was summarized. Based on the above analysis, the systematic evaluation, specific agronomic traits and innovative utilization of tobacco germplasm resources were proposed.【期刊名称】《烟草科技》【年(卷),期】2019(052)007【总页数】9页(P108-116)【关键词】烟草种质;种质资源;烟草育种【作者】焦芳婵;吴兴富;陈学军;许美玲;李永平【作者单位】云南省烟草农业科学研究院,昆明市圆通街33号 650021;云南省烟草农业科学研究院,昆明市圆通街33号 650021;云南省烟草农业科学研究院,昆明市圆通街33号 650021;云南省烟草农业科学研究院,昆明市圆通街33号 650021;云南省烟草农业科学研究院,昆明市圆通街33号 650021【正文语种】中文【中图分类】S572种质资源是重要的自然资源，由自然演化和人工创造而成，是新品种选育的物质基础［1］。
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利用不同分子标记分析烟草种质资源多态性冯吉;程玲;孙光伟;陈振国;蔡长春【摘要】[Objective]To research genetic diversity and relationship in tobacco germplasms.[Method] 53 tobacco materials were distinguish-ed and identified by SSR, EST-SSR and InDel.[ Result]53 tobacco materials could be classified into two groups and two pared with the ESTS-SR and SSR molecular marker , it was less amplification band, strong specificity, easy identification and statistics for InDel marker.Therefore, InDel molecular marker was more suitable for genetic diversity analysis and research of tobacco germplasm .[ Conclusion] The study is useful in revealing the genetic diversity and relationships among tobacco materials , and providing a scientific basis for the germ-plasm identification and genetic linkage mapping.%[目的]研究烟草种质资源的遗传多样性及亲缘关系.[方法]利用SSR、EST-SSR和InDel这3种分子标记对53份不同类型的烟草材料进行区别与鉴定.[结果]53份烟草材料可分为2大类群,2个亚类;与EST-SSR和SSR分子标记相比,InDel分子标记以其扩增谱带少、特异性强,易于识别和统计,更适合用于烟草种质资源遗传多样性分析与研究.[结论]该研究能够较好地揭示烟草栽培品种类型间的遗传多样性与亲缘关系,可为烟草种质鉴定和遗传连锁图谱构建提供科学依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)029【总页数】5页(P139-143)【关键词】烟草;分子标记;遗传多样性【作者】冯吉;程玲;孙光伟;陈振国;蔡长春【作者单位】湖北省烟草科学研究院,湖北武汉430030;湖北省烟草科学研究院,湖北武汉430030;湖北省烟草科学研究院,湖北武汉430030;湖北省烟草科学研究院,湖北武汉430030;湖北省烟草科学研究院,湖北武汉430030【正文语种】中文【中图分类】S188烤烟是我国主要的经济作物之一，其种植面积较大，是卷烟工业重要的基础原料[1]。
但是用于烟草品系选育的材料遗传背景狭窄，且育种周期长和工作效率低制约着传统育种工作的进度，造成我国目前烟草育种创新能力较差[2]。
因此，拓宽烟草栽培品种遗传背景和优化烟草育种选择程序是今后高产、优质、多抗烟草新品种育种工作的关键。
分子生物学的发展及分子标记技术的建立为烟草育种工作提供了可量化、不受环境影响的标准方法，越来越多地被应用到烟草种质鉴定工作中。
SSR、TRAP、AFLP等分子标记具有结果可靠、重复性好、多态性丰富、操作简单等特点，已被应用于烟草种质鉴定中[2-7]。
该研究利用已公布的烟草SSR标记，EST-SSR标记以及自主开发的InDel标记对53份烟草种质资源的亲缘关系进行分析，为烟草种质资源鉴定和遗传育种研究提供新的分子标记，并为拓宽烟草育种遗传基础以及烟草种质资源的研究和利用奠定理论基础。
1.1 不同分子标记1.1.1 EST-SSR引物对序列。
选取多态性较好的16对引物对[8]，引物对序列见表1。
1.1.2 SSR引物对序列。
选取多态性较好的20对引物对[9]，引物对序列见表2。
1.1.3 InDel引物对序列。
随机选择并开发出45对引物对，引物对序列见表3。
1.2 材料试验材料以烤烟为主，并适当选取其他材料，共计53份。
其中烤烟33份，白肋烟15份，晒烟3份，香料烟2份(表4)。
选取新鲜幼嫩的叶片3～5片，每份材料取样3株，每株材料单独保存在超低温冰箱中备用。
1.3 方法1.3.1 CTAB小样法提取DNA。
选取53份烟草种质资源材料的鲜嫩叶片，DNA提取方法参考CTAB 方法[2-7]。
1.3.2 PCR扩增。
PCR反应体系含模板DNA 2 μL，BioTeke的2×power Taq PCR MasterMix(PR1701)5 μL，正向和反向引物(50 ng/μL)各1.5 μL，总体积10 μL。
PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火温度(50～62 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。
在TP600梯度PCR仪(TaKaRa，日本)上进行PCR反应。
1.3.3 多态性引物的筛选。
对53份烟草材料初步筛选InDel，EST-SSR和SSR引物对；选择电泳条带清晰且稳定、多态性丰富的引物对进行DNA扩增。
1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
PCR 扩增产物均用聚丙烯酰胺凝胶(6%)进行电泳分离，电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencing cell(Bio-Rad，USA)，缓冲液为0.5×TBE。
电泳时先用恒定功率100 W 预电泳30 min 左右(玻璃板面温度约为50 ℃)，上样后，用恒定功率80 W 电泳1.0～1.5 h，快速显影方法进行电泳后的染色与显影。
1.3.5 数据处理。
统计数据时，InDel，EST-SSR和SSR多态性定义为在扩增产物凝胶电泳带型的某一相同迁移位置上，品种某一条带的有或无，每1个多态性条带记作1个等位基因(假定相同迁移率的条带均来自同一位点上的同一等位基因)。
将电泳图谱上清晰出现的条带记为“1”，同一位置无带记为“0”，不清楚难以判断的带记为“.”或“-”，获得“0”和“1”组成的数字矩阵。
1.3.6 遗传多样性分析和聚类树的绘制。
将53个烟草种质资源材料的分子标记数据按要求制成表格，并采用聚类软件NTSYS计算遗传相似性系数，然后根据遗传相似性系数进行类平均法(UPGMA，unweighted pair group method arithmetic averages)聚类，形成数字矩阵，绘出聚类树，形成种质资源的分类。
2.1 InDel分子标记的开发利用B37(红)和B37(白)的重测序数据[9]，与已发表的K326和TN90数据[10-11]进行生物信息分析，预测得到353 349个InDel位点。
通过InDel标记建立矩阵，利用矩阵分析样本之间的多态性，参考前人研究筛选参数[12]：插入/缺失碱基数为5～15 bp、插入/缺失变异率(变异率=同类插入/缺失占重测序总样品量的百分比)为30%～70%的InDel位点，最终随机选择并设计出具有代表性InDel引物45对。
2.2 烟草InDel，EST-SSR和SSR的多态性检测2.2.1 InDel分子标记的多态性检测。
用45对InDel引物对53份烟草种质资源材料进行多态性检测，其中只有20对InDel引物多态性检测能力较强，多态性比例为44.44%。
利用这20对InDel引物在53份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的40个多态性位点，每对引物能得到2条多态性条带。
部分InDel引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图1。
2.2.2 EST-SSR分子标记的多态性检测。
用16对EST-SSR引物对53份烟草种质资源材料进行多态性检测，其中只有9对EST-SSR引物多态性检测能力较强，多态性比例为56.25%。
利用这9对EST-SSR引物在53份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的33个多态性位点，每对引物能得到2～6条多态性条带，平均为4条。
部分EST-SSR引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图2。
2.2.3 SSR分子标记的多态性检测。
用20对SSR引物对53份烟草种质资源材料进行多态性检测，其中只有15对SSR引物多态性检测能力较强，多态性比例为75.00%。
利用这15对SSR引物在53份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的70个多态性位点，每对引物能得到2～9条多态性条带，平均为5条。
部分SSR 引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图3。
2.3 烟草遗传多样性分析和聚类树的绘制利用NTSYS软件计算种质资源的遗传相似性系数。
53份材料的遗传相似性系数为0.37～0.97，平均为0.75。
说明53份烟草种质资源的遗传多样性较低，遗传背景变异较少。
基于遗传相似性系数，进一步对53份材料进行聚类分析，绘制了UPGMA聚类图(图4)。
在遗传相似性系数为0.48时，53份材料被分为2类群。
其中第一类群为所有晾晒烟材料(包含白肋烟、晒烟和香料烟)和部分烤烟材料，第二类群为烤烟材料。
第一类群在遗传相似性系数为0.53 处，又可分为2亚类。
第1亚类为大部分的白肋烟材料和部分烤烟材料，第2亚类为全部晒烟、香料烟、部分烤烟以及部分白肋烟材料。
以上结果可以说明：分子标记技术在烟草资源遗传亲缘关系分析中的高效性；晾晒烟种质资源材料与烤烟种质资源材料遗传亲缘关系相对较远，而不同晾晒烟种质资源材料之间(包含白肋烟、晒烟、香料烟)的遗传亲缘关系很近。
随着分子生物学的发展及分子标记技术的建立，越来越多的分子标记被应用到烟草种质鉴定、遗传图谱的构建、抗病性研究等工作中[2-7，9]。
该研究中SSR、EST-SSR和InDel这3种分子标记多态性丰富，稳定性强，试验条件较易掌握，都是很好的烟草遗传多样性分析的分子标记方法。
但是与EST-SSR和SSR分子标记相比，InDel分子标记以其扩增谱带少、特异性强，易于识别和统计，因而更适合用于烟草种质资源遗传多样性分析与研究。
遗传多样性对物种的生存和发展起着决定性的作用，遗传多样性高，对环境变化的适应能力强，容易扩展其分布范围并孕育成新的品种，因此对遗传多样性的研究，可以探讨物种之间的亲缘关系，同时还有助于充分发现和利用各种基因资源，挖掘重要经济性状的变异并加以科学利用和开发。
烟草传入我国已有400 多年时间，虽然经过400多年的人工驯化和培养以及不断地从国外引进已经形成的品种资源，但是近年烟草育种中广泛使用的主体亲本只有少数几种，导致我国育成烟草品种遗传基础日益狭窄[13-14]，该研究结果也从分子水平上印证了我国烟草育种资源的匮乏。