Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程
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Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程（编号：067）1、目的及适用范围
利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器
Ni柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机
3、主要试剂
3.1磷酸盐体系
Binding buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole，pH 8.0；
Wash Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0；
Elute Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，500 mM imidazole，pH 8.0。
3.2 Tris盐体系
Binding buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH8.0；
Wash Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，60 mM imidazole，pH8.0；
Elution Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，500 mM imidazole，pH8.0；
Striping Buffer：20mM Tris，100mM EDTA，500mM NaCl，pH8.0。
酸性Buffer：20mM 醋酸钠，500mM NaCl，pH4.0。
Charge Buffer：0.1M NiSO4
4、操作步骤
4.1 Ni柱的预处理
4.1.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子；
4.1.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni；
4.1.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni；
4.1.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）；
4.1.5用5个柱体积的Binding Buffer平衡柱子。
4.2蛋白的纯化
4.2.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；
4.2.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；
4.2.3 将收集的菌体用Binding buffer重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
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