亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程
GST标签的蛋白纯化
GST标签的蛋白纯化1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬，置于冰上超声10min（超声5s，停10s）。
2.超声所得产物留样1mL，剩余样品4℃，12000rpm离心30min。
3.收集上清，用0.45um的过滤器过滤，留样1mL 。
沉淀用20mL 1×PBS 重悬，留样1mL。
沉淀于-30℃保存。
4.准备Binding Buffer 1×PBS，pH=7.3Elution Buffer 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH=8.0分别加入1mM DTT用于洗脱和结合8.使用蠕动泵将Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速平衡柱。
避免空气进入柱内。
9.使用蠕动泵将样品注入柱中，以1mL/min的流速结合样品，循环上样3次。
10.使用蠕动泵将50mL Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速清洗柱。
11.使用蠕动泵将20mL Elution Buffer注入柱中，以1mL/min的流速结合蛋白。
从第2mL开始，每1mL 产物收集在1.3mL EP管中。
共收集10柱体积的产物。
剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。
12.使用蠕动泵将50mL 超纯水注入柱中，以2mL/min的流速1清洗柱。
13.使用蠕动泵将20mL 20%酒精注入柱中，以2mL/min的流速，当柱中充满酒精时将柱取下保存在4℃。
14.将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min，12000rpm离心10min，吸取上清。
同蛋白产物一同进行SDS-PAGE电泳。
根据电泳结果，推测GST标签蛋白可能以包涵体形式存在于沉淀中接菌pw61，进行小量诱导，并制备蛋白样品根据电泳结果显示，推测GST标签蛋白存在于沉淀中。
Western Blot 未显示有条带，丽春红染色有明显条带，推测使用的GST抗体不能与目的条带特异性结合。
纯化可溶性蛋白3875裂解：将离心好的菌沉淀取出，500 ml菌液用60 ml Buffer A平衡缓冲液将沉淀重悬。
GST融合蛋白表达与纯化
70%（V/V）乙醇
适于水溶液的0.22μm膜
1、在1.5ml的微量离心管中放入1ml表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物，4℃，最高转速离心2min，收集上清，将其过0.22μm的膜，收入1.5ml的微量离心管中，弃沉淀。
材料（带√的项见附录1）
用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株
√M9最低营养培养基加0.5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）
√1000x抗生素贮液
√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）
20ml无菌培养管
150ml摇瓶
37℃定轨摇床
1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。
转化的大肠杆菌宿主菌株
√LB培养基
√1000x抗生素贮液
√20%（V/V）甘油，无菌的
√LB平板
20ml培养管
30℃或37℃定轨摇床
1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落，接种2ml LB培养基（补加适当的抗生素；在20ml培养管中），在定轨摇床上培养过夜。对于基于pL的系统，温度为30℃，对于其他系统，温度为37℃。
辅助方案5 细胞外培养基样品的制备
通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。如果培养物中蛋白质浓度很低（如低于100mg/L），可以加入牛血清白蛋白（BSA）作为沉淀的载体和核。
材料
表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞
2g/L BSA（可选；用0.22μm的膜除菌，4℃保存≤1个月）
GST蛋白表达、纯化步骤(word文档良心出品)
Protein Expression Protocol:1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, growovernight;2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight;3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 MIPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice;5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition;6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12%SDS-PAGE;7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice;9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition;10.Prepare the supernatants for purification.蛋白表达注意事项：1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。
gst蛋白纯化
GST蛋白纯化简介谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种常用的亲和标签，用于在分子生物学研究中用于蛋白质纯化和蛋白质亲和结合实验。
GST蛋白被广泛应用于蛋白质结构和功能研究、酶学研究、蛋白质互作研究等领域。
本文将介绍一种常见的方法来纯化GST蛋白，该方法主要包括以下步骤：细胞裂解、亲和层析、洗脱和纯化。
方法细胞裂解首先需要将GST蛋白表达在适当的宿主中，例如大肠杆菌。
在细胞达到适当的生长阶段后，使用合适的方法将细胞裂解，使得目标蛋白释放到溶液中。
一种常用的裂解方法是超声波裂解，通过超声波震荡将细胞破碎。
亲和层析经过细胞裂解后，将得到的细胞裂解液通过亲和层析柱。
亲和层析柱通常使用含有还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合物质的树脂，例如glutathione agarose beads。
这种树脂与GST标签结合，使得GST标签的融合蛋白能够特异性地结合于柱子上。
通过洗脱液去除非特异结合蛋白，将目标蛋白纯化。
洗脱洗脱过程是将结合于柱子上的目标蛋白从固定相洗净。
一般采用含有高浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液，例如50 mM GSH。
洗脱液中的还原型谷胱甘肽与柱子上的结合物质竞争与GST标签结合，以此达到将GST蛋白洗脱下来。
纯化经过洗脱后，蛋白溶液中的GST蛋白含量较高。
为了进一步提高纯度，可以通过对溶液进行浓缩、去除低分子量杂质、调整溶液pH值等方法进行纯化。
常用的纯化方法包括丙酮沉淀法、离子交换柱层析法等。
注意事项•在实验过程中应严格操作，避免任何可能导致目标蛋白污染的情况发生。
•选择合适的表达宿主，不同的宿主可能会对GST蛋白的表达量和可溶性产生影响。
•在细胞裂解过程中，避免样品受到温度、剧烈振荡等因素的影响。
•注意亲和层析柱的操作方法，避免破损或污染。
•洗脱过程中注意还原型谷胱甘肽浓度和洗脱液的pH 值。
结论GST蛋白纯化是一种常见的蛋白质纯化方法，通过亲和层析技术可以实现对GST蛋白的高效纯化。
GST融合蛋白的纯化
GST融合蛋白的纯化诱导和收集菌体在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。
18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。
IPTG浓度一般为0.1～1.0mM。
5000rpm 5min离心收集菌体。
亲和层析柱的制备取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。
将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。
每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。
在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。
将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。
收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。
0.45um过滤后加入亲和层析柱。
室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。
用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。
配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。
用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。
测各管洗脱液蛋白浓度。
PAGE电泳检测纯度。
亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。
或者按照beads使用说明书上的方法再生。
如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。
如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
gst纯化蛋白步骤
gst纯化蛋白步骤GST纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，它利用谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)的亲和性，将GST标签蛋白与GST结合亲和树脂进行结合，然后通过洗脱，最终得到纯化的目标蛋白。
下面将为大家介绍GST纯化蛋白的详细步骤。
1.构建重组蛋白表达载体：首先需要在目标蛋白编码基因的N端或C端加上GST标签，通常选择GST-N和GST-C两种方式。
将GST标签与目标蛋白基因连接后，将其插入合适的表达载体中。
2.转化宿主细胞：将构建好的重组表达载体转化到适合的宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌和酿酒酵母等。
3.表达目标蛋白：宿主细胞在适宜的培养条件下进行培养，使其产生大量重组蛋白。
常见的培养条件包括温度、培养基的选择和添加诱导物等。
4.细胞破碎：培养得到丰富的重组蛋白的细胞后，通过机械或化学方法将细胞破碎。
常用的方法有超声波破碎、高压均质破碎、冻融法和溶菌酶法等。
5.蛋白纯化：将细胞破碎液进行离心分离，去除残余细胞碎片。
接下来，将蛋白样品加入含有GST结合亲和树脂的柱子中，通过亲和吸附，在树脂上富集GST标签蛋白。
6.洗脱纯化蛋白：使用合适的洗脱缓冲液，可以脱离与亲和树脂结合的非特异性结合蛋白，并洗脱纯化的目标蛋白。
一般使用还原性缓冲液，可将目标蛋白从GST结合亲和树脂上彻底洗脱。
7.蛋白质浓缩：通过合适的方法，如超滤、溶液浓缩装置等，使纯化的目标蛋白浓缩到较高浓度。
8.纯化蛋白的分析：对纯化的目标蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，检测其纯度和分子量等指标。
通过上述步骤，可以得到较高纯度的GST标签蛋白。
需要注意的是，在步骤的选择和操作过程中，要根据目标蛋白的特性和所需纯度等要求进行调整，以获得更好的纯化效果。
希望本文对您进行GST纯化蛋白的实验有所帮助。
GST融合蛋白的纯化
GST融合蛋白的纯化诱导和收集菌体在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。
18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。
IPTG浓度一般为0.1～1.0mM。
5000rpm 5min离心收集菌体。
亲和层析柱的制备取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。
将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。
每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。
在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。
将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。
收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。
0.45um过滤后加入亲和层析柱。
室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。
用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。
配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。
用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。
测各管洗脱液蛋白浓度。
PAGE电泳检测纯度。
亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。
或者按照beads使用说明书上的方法再生。
如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。
如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
纯泰GST(GSH)亲和层析介质使用说明书
z 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析 柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内 空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持 水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方 滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面 低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移 液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子 内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min， 让介质自然沉降。
每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质 进行再生，步骤如下：
1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl, 0.5M
NaCl, pH8.5）和低pH缓 冲液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脱三次。 2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。 7. SDS-PAGE检测：
三、 适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其 它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的 蛋白。
四、 操作说明
1. 缓冲液配制
z 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4， 1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl， 调节pH值至 8.0。
z 缓冲液 B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione
-1-
1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质； 2) 上样； 3) 用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱
中剩余上样液并重新平衡介质； 4) 用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液； 5) 用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程（编号：069）1、目的及适用范围
利用GST亲和层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器
GST柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机
3、主要试剂
3.1 Binding Buffer：1×PBS
3.2 Elution Buffer：20-50mM还原型谷胱甘肽
3.3 高pH值缓冲溶液：0.1M Tris，0.5M NaCl，pH 8.5
3.4 低pH值缓冲溶液：0.1M 醋酸钠，0.5M NaCl，pH
4.5
4、GST柱的预处理
用5个柱体积的1×PBS缓冲溶液平衡柱子
5、操作步骤
5.1蛋白的纯化
5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；
5.1.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；
5.1.3 将收集的菌体用1×PBS重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
5.1.4 将菌体用1×PBS重悬，超声破碎菌体；
5.1.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；
6.1.6 将收集的上清加入GST柱子中，4℃结合2h；
5.1.7 流出穿透液；
5.1.8 用20-30个柱体积的1×PBS冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；
5.1.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；
5.1.10将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
5.2 柱子的再生
5.2.1 用3个柱体积的高pH缓冲溶液冲洗柱子；
5.2.2 用3个柱体积的低pH缓冲溶液冲洗柱子；
141。