四国药典细菌内毒素对比
美国药典24版细菌内毒素检查法 文档
美国药典24版细菌内毒素检查法本文是USP24细菌内毒素检查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的译文，但目前执行的标准是USP24版第二增补本（USP—NF19 Second Supplement）的细菌内毒素检查法，读者可对照学习，从中可看出USP24细菌内毒素检查的不足之处。
本文将介绍用鲎试剂检测样品内或样品上存在的细菌内毒素浓度的方法。
鲎试剂（Limulus Amebocyte,LAL）来自鲎的循环细胞，经水提取而行，制备和检验后，用于凝固法。
反应的终点是将供检样品稀释后，与平行稀释的参考内毒素标准进行直接比较得到的。
测得的内毒素含量用规定的内毒素单位表示。
鲎试剂也是用浊度法或显色法来读取数据的，这些试齐只要能满足这些选择方法的要求，就可以使用。
在做试验时，需要先做出一条标准曲线，并用该曲线计算供检样品的内毒素含量，包括样品和对照液加鲎试剂后的培育时间和在分光光度计上读取光密度时使用的波长等操作，都应该事先规定好。
如果是终点浊度法，则到达培育期后，应立刻读取读数。
而动力学检测（凶手浊度法和显色法），光密度的测定是贯穿于整个反应期间，而用于计算结果的百分数就是从这些读数中计算出来的。
在用终点法的显色法检测时，在到达事先规定的反应时间后，添加停止酶反应的试剂使反应停止后，再读取数据。
1、参考内毒素标准与对照内毒素标准参考内毒素标准（Reference standard endotoxin,RSE）是美国药典（USP）的内毒素参考标准，其效价为每瓶10 000个USP内毒素单位（EU）。
每瓶参考内毒素标准加5ml鲎试剂用水（LAL Reagent Watet），用旋转搅拌器间歇搅拌30min使其溶解，制成原液，用这一原液制作合适的系列稀释。
原液应保存于冰箱中，用于以后的稀释，但保存时间不得超过14d。
用前，用旋转搅拌器强力搅拌至少3min，每一步稀释，至少搅拌30s，然后才能用它稀释下一步。
各国药典细菌内毒素检查法的比较
各国药典细菌内毒素检查法的比较1968年美国科学家Dr. Levin和Bang建立了鲎试验法。
此后世界各国对鲎试剂的生产和应用得以迅速发展。
1980年美国药典20版首先收载了细菌内毒素检查法。
随后,英国药典、日本药局方、中国药典等也相继收载了该方法。
本文主要对中国药典1995年版与英国药典1995年增补本、美国药典23版和日本药局方13版等的细菌内毒素检查法进行了比较。
1 检验品种的比较中国药典1995年版二部共收载细菌内毒素检查品种12个,2000年版二部增至47个,而美国药典23版收载了471个品种进行细菌内毒素检查。
因此,我们需加紧对更多的品种进行细菌内毒素检查方法的研究,加快该法对药品检验的普及和推广工作,提高我国药品标准和检验水平。
2 检验方法的比较细菌内毒素试验的方法有凝胶法、浊度法、显色基质法、免疫学法等。
其中凝胶法多为限量检查法,浊度法和显色基质法为定量检查法,且后两种方法都属于分光光度法。
浊度法还可分为终点浊度法和动态浊度法;显色基质法也可分为终点显色基质法和动态显色基质法。
凝胶法是较为经典的方法,各国药典都有收载,而收载了细菌内毒素定量测定法的有美国药典、英国药典、欧洲药典和日本药局方等。
中国药典1995年版只收载了凝胶法,2000年版才涉及到定量测定法。
因此,我们还需要对细菌内毒素定量测定进行研究,需要有供定量测定用的标准品、仪器和试剂,以后逐步建立起我国的细菌内毒素定量测定方法。
3 细菌内毒素标准品各国药典均设置了细菌内毒素的标准品,其中中国药典、英国药典和美国药典还可采用根据标准品为基准进行标定的工作标准品或对照标准品。
除英国药典采用U为内毒素的单位外,其余各国药典都用EU为内毒素的单位。
美国药典和中国药典对内毒素标准品每一步稀释时的混匀时间作出了明确规定。
除中国药典外,其余各国药典规定了内毒素标准贮备液在冰箱里保存不得超过14d,且用前应在旋涡混合器上充分混合至少3min。
注射剂热原和细菌内毒素检查
1→3-β-D葡聚糖
B因子
活化B因子 活化G因子
G因子
前凝固酶
凝固酶(显色基质法)
凝固蛋白原
凝固蛋白
(比浊法,凝胶法)
鲎试剂凝集反应过程
二.热原和细菌内毒素检查方法
（一）.四国药典比较
❖ 热原：家兔体重（无上限），初温，测定 次数，结果判断
❖ 细菌内毒素：方法，标准品（保存时间）， 检查用水（限值），试验准备（除热原， PH），检查限值，关于0.5~2.0的范围
中国药典部分注射剂计算限值与规定限值差异
品名 人最大用量 计算限值 规定限值
❖ 5%葡萄糖 5ml/kg.h 1EU/ml 0.5EU/ml
❖ 50%葡萄糖 1ml
5 (10EU/g) 0.5
❖ 两性霉素B 0.16mg 30EU/mg 15EU/mg
❖ 青霉素钾(钠)16万IU 0.00003EU/IU 0.0001
克林霉素
0.1
0.58
（四）.2005版检查品种的增加研究
❖ 1).拟定了中美英药典热原内毒素对照表
化学药品约120种，生物制品约35种，根据 人用最大剂量参考热原和国外药典，初步 确定内毒素限值。
❖ 2).分工研究，化学药品146种，确定了研究 的指导原则，28家药检所负责
❖ 3).试验结果
❖ ①多数品种比较一致，用0.125～0.5EU/ml 灵敏度可以进行限值检测
❖ ②有的品种需要用0.03～0.06EU/ml才可检 测（肝素钠，放线菌素D等）
❖ ③少数品种不干扰浓度相差较大 抑肽酶 0.75u/ml 14u/ml 妥布霉素 0.5mg/ml 0.125mg/ml 丝裂霉素 1mg/ml 0.0125mg/ml 葡萄糖酸钙注射液 0.3125mg/ml；5mg/ml 氯唑西钠 5mg/ml 1.25mg/ml
四国药典细菌内毒素对比
.CP(2015版)1143EP（8.0）2.6.14USP（36）85JP（16）6.06定义CP(2015) EP(8.0) USP(36) JP(16)本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内素素本法利用鲎试剂（从美洲鲎或中华鲎——阿米巴细胞溶解产物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（美洲鲎或中华鲎）阿米巴细胞溶解产物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（ LAL）检定内毒素本法利用鲎试剂（从美洲鲎或中华鲎——阿米巴细胞溶解产物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量方法CP(2015) EP(8.0)一、凝胶法二、光度测定法1、浊度法2、显色基质法方法 A：凝胶法：限度试验方法 B：凝胶法：定量试验方法 C：动态浊度法方法 D：终点显色法方法 F：终点浊度法.USP(36) JP(16)仪器CP(2015) EP(8.0) USP(36) JP(16)一、凝胶法二、光度测定法1、浊度法2、显色法一、凝胶法二、光度测定法1、浊度法2、显色法干热灭菌法（250℃， 30 分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰干热灭菌法（250℃， 30 分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰干热灭菌法（250℃， 30 分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰干热灭菌法（250℃， 30 分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰溶液制备CP(2015) EP(8.0)供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液( 或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH 值在 6.0-8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH 值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检査用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
中美药典细菌内毒素比较(word文档良心出品)
------------USP：在复试中，如果溶液A的两支平行管均为阴性，供试品溶液符合规定
USP：如果供试品溶液以不超过MVD的某个稀释倍数稀释，检测结果为阳性时，可进一步稀释供试品溶液但不能超过MVD，再重新进行试验。------CP；无规定。
USP：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。
CP：用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，内毒素含量应小于0.005EU/ml。
USP： 未提到。
3、实验用具的准备
CP：实验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰定义，等于K/M
除了鞘内给药以外的任何给药途径，K均为5 USP-EU/kg，鞘内给药时，K为0.2 USP-EU/kg，对于非鞘内给药放射性药品，内毒素限值的计算为175/V，V为以mL为单位的最大推荐剂量，对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值为14/V，对于按以每平方体表面积计算的给药剂量（通常是抗肿瘤药品），计算公式为K/M，其中K=5EU/kg，M为（最大剂量/m2/小时×1.80m2)/70kg。
5、供试品溶液的制备
CP：|某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提 用LRW复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。
USP：用LRW复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。
中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较
中国药典和美国药典的内毒素检测要求
鲎试剂－LAL，中国药典和美国药典的内毒素检测要求鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。
鲎试验法是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，它简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，因而被欧美药典及我国药典定为法定内毒素检查法，并已被世界各国所采用。
目前国际上销售的鲎试剂有两种，一种称美洲鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate），缩写为LAL，由美国生产；另一种称东方鲎鲎试剂（Tachypleus Amebocyte Lysate），缩写为TAL。
实验证明：美洲鲎试剂-LAL比东方鲎试剂LAL更纯洁，检测效果更好。
TAL检查内毒素有很多方法，目前应用最广泛的是凝胶法，此外还有动态浊度法﹑显色基质法,比色法等。
其用途有以下几方面：1. 药检：用于注射药品﹑放射性药物﹑生物制品﹑注射器及生产工艺流程中的内毒素检测；2. 临床：用于检测病人各种体液中的内毒素含量；3. 其他：用于检测水或食品中的内毒素含量。
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法-鲎试剂法》(鲎试剂－LAL法)本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
四国药典细菌内毒素对比
EP(8.0)
最大有效稀释倍数（MVD）指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVD按下列公式确定：
MVD = 内毒素限值×供试品溶液浓度/λ
内毒素限值：在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为K/M
JP(16)
内毒素储备标准溶液的制备
以BET检查用水溶解内毒素10000对照标准品或内毒素100对照标准品，制取细菌内毒素试验（BET）的内毒素储备标准溶液。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。1EU相当于1个内毒素国际单位（IU）。
内毒素标准溶液的制备
充分混合内毒素储备标准溶液后，用水稀释，即得BET检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
EP(8.0)
内毒素储备标准溶液的制备
用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。
内毒素以国际单位（IU）表示。IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
EP(8.0)
干热灭菌法（250℃，30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰
USP(36)
干热灭菌法（250℃，30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰
JP(16)
干热灭菌法（250℃，30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰
溶液制备
CP(2015)
供试品溶液的制备
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液(或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检査用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
药典三部(版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法之答禄夫天创作本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌发生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包含两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包含浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操纵过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）暗示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家尺度品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作尺度品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中尺度曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作尺度品系以细菌内毒素国家尺度品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中尺度曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水尺度，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿经常使用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采取其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素而且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
需要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）暗示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）暗示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）暗示，人均体重按60kg计算，人体概况积按1.62㎡计算。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CP(2015 版)1143 EP (8.0) 2.6.14 USP( 36) 85JP( 16) 6.06仅在最低浓度的标准溶液的所有平行管的检查结果均为阴性的情况下，试验方为有效。
反应终点浓度指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
将终点浓度取对数，计算它们的平均值，再将平均值的结果取反对数，最后的表达式如下：终点浓度的几何平均值=lg-1（工e/f）工e =所用系列溶液的终点浓度的对数值的和f=平行管的数量反应终点的浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测量值（IU/ml ）。
当终点浓度的几何平均值在0.5入至2.0入之间时，可判定受试鲎试剂的标示灵敏度为入，可用于内毒素的检查。
（ii ）干扰因素试验开展该项实验的目的是检查供试品溶液中反应的增强因素或阻抑因素的存在。
按表2.6.14.-1 制备溶液A B、C D。
供试品的稀释度不得超过MVD且供试品溶液不能检查出内毒素，具体操作见（1）预备试验的（i ）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表 2614-1人=经检查无内毒素的溶液工e为所用系列溶液的终点浓度的对数值的和；f为平行管的数量。
反应终点的几何平均值即为LAL试剂的标示灵敏度（单位为EU/mL。
当终点浓度的几何平均值在0.5入至2.0入之间，可判定受试 LAL试剂的标示灵敏度为入。
凝胶法的干扰因素试验一一按表1制备溶液A B C D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD勺溶液，按LAL试剂灵敏度复核试验项下操作。
用检查法给出的公式计算溶液B、C的反应终点的几何平均值。
示灵敏度范围内时，试验方有效。
计算溶液B的鲎试剂灵敏度，如果值在 [0.5入，2.0入]间，可判定供试品溶液在该浓度下无干扰作用；反之则判定供试品溶液对试验能形成干扰。
若供试品溶液在小于 MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD勺进一步稀释，再重复干扰试验。
使用灵敏度更高如溶液的平行管的检查结果均为阳性时：- 如供试品的稀释倍数为 MVD供试品不符合规定。
- 如供试品的稀释倍数小于 MVD应将供试品溶液稀释至较大但不超过MVD的倍数，再次开展实验。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。
USP(36) 方法一一按表2制备溶液A B、C、0按凝胶法预备实验的 LAL试剂标示灵敏度复核试验项下操作。
以该四种溶液为一组试验的供试品, 每组试验做两组平行。
结果判断一一只有阳性对照溶液B和C的平行管的试验结果均为阳性、阴性对照溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。
溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符合试验的内毒素限度要求。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性,供试品不合格。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。
若供试品溶液再小于MVD的稀释倍数下得到的试验结果为阳性，应将供试品溶液以更大的但不超过MVD勺倍数进行稀释，再次开展试验。
JP(16) 按鲎试剂标示灵敏度复核试验项下有关形成含内毒素的坚实凝胶的说明进行操作，该法可检查供试品溶液的内毒素含量是否超出了内毒素限度。
(i ) 方法按表2制备溶液A、B、C D。
以该四种溶液为一组试验的供试品，每组试验做两组平行。
根据（1）预备试验项下的（ii ）干扰因素试验的说明制取溶液A和B。
孵育温度、孵育时间和形成凝胶的确认方法见（1）预备试验的（i）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表 2（ii）结果判断只有溶液B和C的平行管的试验结果均为阳性、溶液D的平行管的试验结果均为阴性时，试验方有效。
溶液A的平行管的试验结果均为阴性时，可判定供试品符合试验的内毒素限度要求。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
如复试中，溶液A的两个平行管均呈阴性，可将供试品判为符合内毒素限度要求。
以MVD稀释的溶液A的两个平行管均为阳性时，供试品不符合内毒素限度要求。
若供试品溶液再小于MVD勺稀释倍数下得到的试验结果为阳性，应将供试品溶液以 MVD咅数进行稀释，再次开展试验。
凝胶半定量试验本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
按表3制备溶液A、B C和0按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
CP(2015)结果判断若阴性对照溶液D勺平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5-2入，试验有效。
系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以入，为每个系列的反应终点浓度。
如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓度c。
若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。
每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度［按公式C=antilg（刀c/2）］。
若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于入（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于入乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。
若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。
当供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以 入。
表3注：A 为不超过MV 并且通过干扰试验的供试品溶液。
从通过干扰试验的稀释倍数开始用检査用水稀释至 1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVDB 为2入浓度标准内毒素的溶液 A （供试品阳性对照）。
C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D 为阴性对照。
（i ） 方法通过将供试品滴定至反应终点，对供试品所含的细菌内毒素定量。
按表 2.6.14-3 制备溶液 A B 、C 、D 。
以该四种溶液为一组试验的供试品，每组试验做两组平行。
具体实验操作见（ 1）预备试验的（i ）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表 2.6.14-3EP(8.0)（i ）方法按表3制备溶液A、B、C D。
以该四种溶液为一组试验的供试品，每组试验做两组平行。
根据（1）预备试验项下的（i i）干扰因素试验的说明制取溶液 A和B。
孵育温度、孵育时间和形成凝胶的确认方法见（1）预备试验的（i ）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项。
表3*可适当调整溶液A的稀释倍数，但不得超过MVD（ii ）计算和结果判断符合下列三个条件时，可将试验判为有效：（a）阴性对照溶液 D的两组平行管均显阴性，（b）供试品阳性对照溶液 B的两个平行管均显阳性，（c）溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5入一2入之间。
反应终点指溶液 A的系列稀释液中最后一管呈阳性。
计算溶液A的内毒素浓度时，应将内毒素浓度记为终点稀释倍数乘以入。
用（1）预备试验项下的（i ）鲎试剂标示灵敏度的复核试验项下的公式计算两组平行实验的内毒素浓度的几何平均值。
如溶液A的稀释液均显阴性，应记为内毒素浓度小于入乘以溶液A的最小稀释倍数。
如溶液A的所有稀释液均呈阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以入。
根据溶液A的内毒素浓度的平均值计算供试品的内毒素浓度（单位为EU/mL EU/mg EU/mEq EU/unit ）。
光度测定法注：A B 为加人了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液 A有相同稀释倍数的供试品溶液。
CP(2015)法。
动态显色法（方法 D）是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。
根据鲎试剂生产商的建议，光度测定试验应在孵育温度下进行（通常为37土 1 C）。
（3）预备试验为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。
当实验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需要验证试验方法。
（i）标准曲线的可靠性试验用内毒素标准溶液制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。
按照鲎试剂生产商的建议（体积比、孵育时间、温度、pH等），每一内毒素标准浓度的溶液至少做三支平行管。
使用动态法检测时，如预期范围超过 2 log，为使标准曲线反映出每个对数增长，应相应增加标准品溶液。
在鲎试剂生产商规定的内毒素浓度范围内，相关系数的绝对值丨r丨必须大于等于0.980。
（ii ）干扰因素试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。
按表2614-4 制备溶液A、B、C D。
在鲎试剂生产商的建议测试条件（供试品和鲎试液体积、供试品于鲎试液的体积比、孵育时间等）下，对这些溶液开展试验，每种溶液至少做两组平行。
表 2.6.14-4溶液人=稀释倍数不超过 MVD勺供试品溶液。
溶液B=加入了标准曲线终点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的、且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
溶液C= 如“ 3.预备实验（i ）标准曲线的可靠性试验”项下描述的、用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
溶液D=BET检查用水（阴性对照）用含标准内毒素的供试品溶液的平均内毒素含量减去供试品溶液的平均内毒素含量，计算内毒素的平均回收率。
止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的定量关系来测定内毒素含量的方法。
动态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色法系利用检测 LAL试剂与内毒素反应使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素的含量的方法。
这种方法也可分为终点显色法和动态显色法。
终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的定量关系来测定内毒素含量的方法。
动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预定吸光度（或透光率）所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。
根据LAL试剂生产厂家的建议，光度测定试验的试验温度一般为37 ± 1 C。
光度测定法的预备试验为确保浊度法和显色法试验结果精确、有效，应根据下面的说明，预先进行标准曲线的可靠性和干扰因素试验。
如试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，必须重新进行验证。
标准曲线的可靠性试验一一用内毒素标准溶液，制成至少三个浓度的稀释液，以获取标准曲线。
根据LAL试剂生产厂家的说明（体积比、孵育时间、温度、pH等），每种标准内毒素浓度至少做三支平行管。
如动态法的预期范围超过2个对数，为使标准曲线反映出每个对数增长），应相应增加标准品溶液。
根据 LAL试剂生产厂家的要求，相关系数的绝对值丨r丨必须大于等于0.980。
干扰因素试验一一选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。
按表4制备溶液A B、C D,每种溶液至少做两组平行。
遵照LAL试剂生产厂家的说明（供试品和LAL试剂体积、供试品与 LAL试剂的体积比、孵育时间等），对这些溶液开展试验。