脱氢酶活性检测方法
脱氢酶测定实验报告
1. 了解脱氢酶的特性和作用机制。
2. 掌握脱氢酶测定实验的方法和原理。
3. 学会使用分光光度计进行脱氢酶活性的测定。
二、实验原理脱氢酶是一类催化氧化还原反应的酶，可以将底物中的氢原子转移给辅酶，从而实现底物的氧化。
本实验以乳酸脱氢酶（LDH）为例，通过测定其在特定条件下催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率，来间接反映LDH的活性。
三、实验材料1. 乳酸脱氢酶（LDH）提取液2. 乳酸（底物）3. 丙酮酸（产物）4. 磷酸缓冲液5. 分光光度计6. 移液器7. 试管8. 秒表四、实验方法1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取一定量的磷酸缓冲液，加入LDH提取液，作为对照组。
3. 设置实验组：取一定量的乳酸，加入LDH提取液，作为实验组。
4. 测定吸光度：将对照组和实验组的试管放入分光光度计中，在特定波长下测定吸光度。
5. 计算反应速率：根据吸光度变化，计算LDH的活性。
1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取1ml磷酸缓冲液，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A0。
3. 设置实验组：取1ml乳酸，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A1。
4. 加入丙酮酸：向实验组中加入1ml丙酮酸，混匀后立即放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A2。
5. 计算反应速率：计算A1与A0的差值（ΔA），ΔA表示在反应过程中吸光度的变化。
根据反应速率公式：反应速率= ΔA / Δt其中，Δt为反应时间，本实验中Δt为1分钟。
六、实验结果与分析1. 通过实验，成功测定了LDH的活性，得到实验数据如下：A0 = 0.3A1 = 0.6A2 = 0.92. 计算反应速率：ΔA = A1 - A0 = 0.6 - 0.3 = 0.3Δt = 1分钟反应速率= ΔA / Δt = 0.3 / 1 = 0.33. 结果分析：根据实验结果，LDH在1分钟内催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率为0.3。
脱氢酶活性的测定
脱氢酶活性的测定一.实验目的了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法二.实验原理活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。
参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。
其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。
如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。
因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。
脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。
利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：无无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。
三.实验设备及药品1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2．4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g 葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。
3. Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）：称取 6.037g Tris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯），再加入20ml 1mol/L的盐酸，再定容至1L。
4. 10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。
5. 无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。
四.实验步骤1．标准曲线的绘制⑴不同浓度的TTC系列溶液的配置：从TTC溶液中移取1，2，3，4，5，6，7mL放入七个50mL的容量瓶中，定容到50mL。
⑵取7支试管，分别加入2mL Tris-HCl缓冲溶液、2mL无氧水、2mL不同浓度的TTC溶液,第八支为对照组。
琥珀酸脱氢酶活性的测定
COOH
CH2
+ MB
CH2
COOH 琥珀酸
COOH HC CH + MB·2H HOOC 反丁烯二酸
在无氧环境下 ，琥珀酸脱氢酶的活性与甲烯兰脱 色的速度成正比，使定量甲烯兰脱色所需时间的倒数， 可以用来表示酶的活性。本实验用液态石蜡制造无氧环 境，这样可以不用真空设备或氮气。
二、实验用品
1、材料 新鲜肌肉糜
四、实验结果
37℃水浴中保温随时观察并记录甲烯兰脱色过程和时 间，酶活力=1/时间
五、思考题
1.琥珀酸脱氢酶活性的测定的原理是什么? 2.实验过程中要注意哪些问题? 3.酶活性测定的方法有哪些?
实验十五 琥珀酸脱氢酶活性的测定
Exp.15 Activity Determinatase
一、实验原理
以脱氢方式使物质氧化的酶，称脱氢酶。琥珀酸脱 氢酶(succinate dehydrogenase)是三羧酸循环中的一个 酶，能促使琥珀酸脱氢成为反丁烯二酸，并将脱下的氢 传递给受氢体。用甲烯兰作受氢体，结果甲烯兰被氢还 原生成无色的甲烯白。
2、试剂 （1）0.01%甲烯兰溶液； （2）0.02M琥珀酸溶液 （3）液态石蜡；
3、仪器设备 试管及试管架、恒温水浴锅、1毫升及2毫升的吸量
管、烧杯。
三、方法和步骤
取2支试管，各加0.02M琥珀酸溶液0.5毫升，0.01% 甲烯兰溶液1毫升和液态石蜡溶液2毫升。再分别加入 0.5克肌肉糜和煮过的肌肉糜分别混匀后，将试管放入 37℃水浴中保温，随时观察并记录甲烯兰脱色过程和时 间，酶活力=1/时间。
细菌脱氢酶活性的测定
细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定摘要休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，是测定细菌脱氢酶活性的良好材料。
本实验用E.coli cVcc249菌株作为实验材料，制备其休止细胞，再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、α-酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的α-酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度，研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。
在本次实验中，所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑盐还原法，噻唑盐宜与反应生成的还原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，可溶解于二甲亚砜中，再根据其颜色变化的深浅，用分光光度计测其OD510nm值，即可表示细菌脱氢酶的活性。
AbstractThe resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration, the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, α-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of α-ketoglutaric acid and sodium citrate perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purple crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.关键词休止细胞脱氢酶活性α-酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐1.引言1.1 休止细胞1.1.1 休止细胞的定义及特性休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明乳酸脱氢酶（LDH）法操作说明操作简介：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种常用的生物化学分析方法。
本文将详细介绍使用乳酸脱氢酶法进行实验操作的步骤。
材料准备：1. 乳酸脱氢酶试剂盒2. 样品溶液3. 乳酸标准品4. 实验用试管和显微管操作步骤：1. 样品制备- 将待测样品装入实验用试管中。
每个样品应分别装入不同的试管，以避免交叉污染。
- 若样品过浓稀，需要进行适当的稀释，确保样品浓度在测试范围内。
2. 标准曲线制备- 准备不同浓度的乳酸标准品溶液，浓度范围可根据实验要求而定。
- 将不同浓度的标准品溶液分别装入实验用试管中。
3. 试剂添加- 分别向样品管和标准品管中加入相同体积的乳酸脱氢酶试剂，充分混匀。
4. 反应温育- 将所有试管置于恒温水浴中，温度设定为适合乳酸脱氢酶反应的温度（一般为37°C）。
- 在设定的反应温度下，将试管保持在水浴中反应一段时间（时间根据实验要求而定）。
5. 反应终止- 在反应时间结束后，以适当的方法终止反应。
常见的终止方式是添加酸性试剂或采用其他合适的方法。
6. 测定乳酸脱氢酶活性- 使用光度计、分光光度计或其他合适的仪器，测定样品和标准品反应后产生的光吸收值。
吸收值与乳酸脱氢酶活性成正比。
- 通过标准曲线，将样品的吸收值转化为对应的乳酸脱氢酶活性。
注意事项：1. 本实验操作需要严格按照实验室安全操作规范进行，避免任何可能导致个人受伤或污染的行为。
2. 实验过程中的试剂、标样和废液等应按照实验室规定的方法处理，不得随意丢弃。
3. 在操作过程中，保持实验器材和试剂的洁净，尽量避免外界因素对实验结果的影响。
4. 操作时需注意避免交叉污染，尤其是样品的装管和试剂的配比过程。
5. 样品和标准品的选择要合适，浓度范围应覆盖实验要求。
6. 温育过程中，确保试管能均匀受热，并避免发生温度不稳定的情况。
总结：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种可靠的生物化学分析方法，适用于乳酸脱氢酶活性的测定。
连续监测法测定乳酸脱氢酶(LD)总活性的原理和意义
连续监测法测定乳酸脱氢酶（LD）总活性的原理和意义一、原理连续监测法是一种基于光学原理的LD活性测定方法。
通常，LD的活性可以通过测定在340 nm波长下NADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）消耗的速率来反映。
当LD催化乳酸转化为丙酮酸时，同时将NADH氧化为NAD+，这个氧化过程会伴随着光吸收的变化。
通过连续监测样品在340nm波长下的吸光度变化，可以计算出LD的活性。
1.将样品中的LD与乳酸和NADH反应。
2.通过测量样品在340 nm波长下的吸光度的变化，可以获得LD的活性。
3.将样品在反应过程中的吸光度变化绘制成曲线，通过计算曲线的斜率，可以得到LD的活性。
二、意义LD是一种存在于细胞质中的酶，广泛存在于人体组织和器官中，特别是心肌、肝脏和肌肉组织。
LD在糖酵解途径中发挥重要作用，催化乳酸转化为丙酮酸，同时将NADH氧化为NAD+。
因此，测定LD的活性可以用来判断糖酵解途径的功能和疾病的发生与发展。
1.诊断心肌梗死：心肌梗死是导致心肌坏死的一种病变，病变区域心肌组织LD活性升高。
通过测定血清中LD的活性可以辅助诊断心肌梗死。
2.评估肝功能：肝脏是LD的重要合成部位，肝功能异常会导致LD活性的改变。
因此，测定血清中LD的活性可以评估肝功能是否正常。
3.监测肌肉损伤：肌肉损伤会导致LD释放到血液中，因此测定血清中LD的活性可以监测肌肉损伤的程度。
4.鉴别疾病类型：不同类型的疾病会导致乳酸代谢的改变，如肝病、心血管疾病等。
通过测定血清中LD的活性可以鉴别不同类型的疾病。
总结连续监测法测定LD总活性是一种常用的临床实验室检测方法，通过测定LD的活性可以判断糖酵解途径的功能和一些病理情况。
该方法的原理基于光学原理，通过测量样品在340 nm波长下的吸光度的变化来计算LD的活性。
连续监测法测定LD总活性在临床上具有重要意义，可以辅助诊断心肌梗死、评估肝功能、监测肌肉损伤以及鉴别不同类型的疾病。
α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)测定标准操作规程
-羟丁酸脱氢酶（Q-HBDH）测定标准操作规程1.检验原理：（酶学速率法）羟丁酸脱氢酶催化酮丁酸还原为羟基丁酸，在此过程中，还原型辅酶I（NADH）被氧化为氧化型辅酶I（NAD+）,通过在340nm处监测吸光度下降的速度，即可计算出样本中a-羟丁酸脱氢酶的活力。
A-酮丁酸+NADH+H+3建J邀脱和＞a-羟基丁酸+NAD+3.样本要求：静脉采血。
新鲜无溶血血清。
2〜8℃保48小时，-20C保存7天，样本不可反复冻融！样本中抗坏血酸含量W0.3g/L、胆红素含量≤0.4g∕L血红蛋白含量W5.Og/L、乳糜含量W5.Og/L对检测结果基本无影响。
4.检验方法；仪器法（详见DF-603∕Db600标准操作规程）6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V）的氯化钠溶液稀释样本.建议最大稀释不超过10倍。
7. 2.单位换算：ukat∕L=U∕L×16.67×10^37.检验方法的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊，或以水空白在340nm处吸光度小于0.800时不能使用。
8.3检验结果仅供参考，不作为临床诊断的唯一依据。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：无色透明液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3试剂空白8.3.1试剂空白吸光度：在37℃、34Onm处，光径ICm时，空白吸光度A21.0008.3.2试剂空白吸光度变化率:在370C>340nm处，光径Icm 时,ΔAU∕L∕min≤0.002.8.4分析灵敏度：在340nm处，光径ICm时，测量1U/L的α-羟丁酸脱氢酶时，吸光度变化4AlV∕minL26XIO-9.5线性区间:试剂的线性区间为[25-750]U∕L,在此线性区间内：a)线性相关系数r应不小于0.9900；b)[25TOO]U∕L区间内，线性绝对偏差不超过土10U∕Lo[10L750]U∕L区间内，线性相对偏差不超过±10%。
脱氢酶活性测定实验报告
脱氢酶活性测定实验报告TTC标准曲线的绘制：TTC浓度(ug/mL) 8 16 24 32 40 吸光值A 0.041 0.186 0.298 0.312 0.456土壤脱氢酶的吸光值记录：编号 1 2 3 平均吸光值A 0.145 0.167 0.186 0.166由标准曲线可得相应TTC浓度为：2.0314 ug/mL则土壤脱氢酶活性= ABC= 2.0314*18*1= 36.5652式中：A为查出的TTC浓度(ug/mL)；B为培养时间校正值(18h);C为比色时稀释倍数(1)。
思考题：1.影响脱氢酶活性的因素有哪些？答：pH：每种酶都有最适pH，在此pH下，酶活性最大；温度：酶活性随着温度的升高而增加，在最适温度时达到最高值，然后开始下降；激活剂：可以促进酶活性；抑制剂：会使酶活性降低；还有内因如底物浓度和酶浓度。
2.已知乳酸脱氢酶（LDH）在NAD+的递氢作用下，使乳酸脱氢生成丙酮酸。
丙酮酸在碱性溶液中与2,4-二硝基苯肼生成2,4-二硝基苯腙使溶液呈蓝色。
颜色的深浅与丙酮酸浓度成正比。
请设计一个测定动物肝脏乳酸脱氢酶活性的实验。
答：1，校正曲线的制作：（1）按下表操作：加入物(ml) B 1 2 3 4 5丙酮酸标准液0 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2底物缓冲液0.5 0.475 0.45 0.4 0.35 0.3去离子水0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于金氏单位0 125 250 500 750 1000（2）37度水浴15分钟，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。
以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。
2，酶活性的测定：（1）加入物(ml) 测定管对照管血清0.01 0.01NAD＋底物缓冲液0.5 0.5（37度水浴5min）NAD＋溶液0.1 －（37度水浴15min）2,4二硝基苯肼0.5 0.5NAD＋溶液－0.1（37度水浴15分钟）0.4mol/L溶液 5.0 5.0（2）混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零，读取各管吸光度。
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活性污泥脱氢酶活性的测定
一.实验目的
了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法
二.实验原理
活性污泥法对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。
参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。
其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现石油烃的氧化和转化。
如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。
因此，脱氢酶的活性可以反应处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。
脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。
利用TTC作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：
无色的TTC受氢后变成红色的TF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD 值），从而计算TF的生成量，求出脱氢酶的活性。
三.实验设备及药品
1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿
2．4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）和2g葡萄糖(0.1mol/L)分析纯溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中，贮存于棕色瓶中，一周更换一次。
3. Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）：称取6.037g Tris（三羟甲基氨基甲烷，分析纯），再加入20ml 1mol/L 的盐酸，再定容至1L。
4. 10%硫化钠：称取10gNa2S（分析纯），定容到100mL的容量瓶中。
5. 无氧水：0.36g亚硫酸钠定容到100ml容量瓶中。
四.实验步骤
1．标准曲线的绘制
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