实验6 乳酸脱氢酶的活性测定
乳酸脱氢酶测乳酸的方法
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，简称LDH）是一种酶，它在乳酸的代谢中起着关键作用。
测量乳酸浓度和LDH活性对于监测细胞代谢和疾病诊断非常重要。
以下是一种常见的用于测定乳酸浓度的方法：
### 酶联免疫吸附法（Enzymatic Assay）
这是一种基于酶催化反应的常规测定方法，包括以下步骤：
1. **样品准备：** 采集血液、细胞培养液或其他液体样品。
必要时，对样品进行适当的处理，以提取乳酸。
2. **试剂准备：** 准备LDH酶联试剂盒，其中包括LDH酶、辅酶、底物和其他必要的试剂。
3. **混合：** 将样品和试剂混合，使LDH与样品中的乳酸反应。
4. **酶催化反应：** LDH催化乳酸与辅酶之间的反应，产生氧化的底物。
5. **测量吸光度：** 使用分光光度计或酶标仪器测量在特定波长下产生的吸光度变化。
吸光度的变化与乳酸浓度成正比。
6. **计算浓度：** 使用标准曲线或浓度计算公式，将吸光度转化为乳酸的浓度。
请注意，具体的操作步骤和使用的试剂可能因不同厂家的试剂盒而异，因此在进行实验时应遵循所选试剂盒的操作手册和说明。
此外，还有其他方法可用于测量乳酸浓度，例如电化学法和核磁共振（NMR）法。
选择适当的方法取决于实验的具体需求和设备的可用性。
脱氢酶测定实验报告
1. 了解脱氢酶的特性和作用机制。
2. 掌握脱氢酶测定实验的方法和原理。
3. 学会使用分光光度计进行脱氢酶活性的测定。
二、实验原理脱氢酶是一类催化氧化还原反应的酶，可以将底物中的氢原子转移给辅酶，从而实现底物的氧化。
本实验以乳酸脱氢酶（LDH）为例，通过测定其在特定条件下催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率，来间接反映LDH的活性。
三、实验材料1. 乳酸脱氢酶（LDH）提取液2. 乳酸（底物）3. 丙酮酸（产物）4. 磷酸缓冲液5. 分光光度计6. 移液器7. 试管8. 秒表四、实验方法1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取一定量的磷酸缓冲液，加入LDH提取液，作为对照组。
3. 设置实验组：取一定量的乳酸，加入LDH提取液，作为实验组。
4. 测定吸光度：将对照组和实验组的试管放入分光光度计中，在特定波长下测定吸光度。
5. 计算反应速率：根据吸光度变化，计算LDH的活性。
1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取1ml磷酸缓冲液，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A0。
3. 设置实验组：取1ml乳酸，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A1。
4. 加入丙酮酸：向实验组中加入1ml丙酮酸，混匀后立即放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A2。
5. 计算反应速率：计算A1与A0的差值（ΔA），ΔA表示在反应过程中吸光度的变化。
根据反应速率公式：反应速率= ΔA / Δt其中，Δt为反应时间，本实验中Δt为1分钟。
六、实验结果与分析1. 通过实验，成功测定了LDH的活性，得到实验数据如下：A0 = 0.3A1 = 0.6A2 = 0.92. 计算反应速率：ΔA = A1 - A0 = 0.6 - 0.3 = 0.3Δt = 1分钟反应速率= ΔA / Δt = 0.3 / 1 = 0.33. 结果分析：根据实验结果，LDH在1分钟内催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率为0.3。
乳酸脱氢酶测定—速率法(精)
430
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U/L
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参考范围:104-205U/L 式中6 220为波长340nm处NADH的摩尔 吸光度。
方法评价
1.L-P反应速率法是根据正向反应而建立，其优点在
于：乳酸盐和底物溶液的稳定性较好，－20℃保存 可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的 影响最小。 2.线性范围较宽 本法在LDH活性为726U/L以内时 线性良好。超过此值最好将标本稀释后再测。 3.精密度好 LDH活性为65U/L时，日间CV为5.8%； LDH活性为149U/L时，日间CV为3.2%。 4.特异性高 由于血清中非LDH的NAD＋类氧化还原 酶的内源性底物很少，加上样本的高度稀释，因此， 这些酶的干扰作用可忽略不计。
LDH pH 8.8 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H
实验操作
样本要求:当日空腹采集的无溶血、无乳糜的
血清 试剂配制：取R15ml加R21ml混合即为工作试 剂 半自动生化分析仪测定参数
半自动生化分析仪测定参数
分 析 方 法 速 率 法 速 率 法 波长 温 度 试 剂 空 白 延 迟 时 间 30s 测 量 时 间 45s 因数 样 品 量 uL 试 剂 量 uL 吸 入 量 uL 500 单 位 反 应 方 向 正
乳酸脱氢酶测定—速率法
xiaobinxuer@
实验目的
熟悉血清乳酸脱氢酶测定（速率法）的原理，
测定参数的设置及酶活性单位的计算
实验原理
乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时
乳酸脱氢酶同工酶的提取及活力测定
乳酸脱氢酶同工酶的提取及活力测定
姜玉梅;杨歌德;范业鹏;李冀宏;王爱民
【期刊名称】《哈尔滨医科大学学报》
【年(卷),期】1999(33)1
【摘要】以兔肌为实验材料，常规处理组织匀浆，差速离心，取微量上清液经稀释后为酶样品。
以丙酮酸、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤＨ）为底物，测定ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的吸光度改变以判定乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）的活力。
结果表明，所提取的ＬＤＨ具有明显活力。
【总页数】2页(P71-72)
【关键词】乳酸脱氢酶;LDH;同工酶;活力
【作者】姜玉梅;杨歌德;范业鹏;李冀宏;王爱民
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】Q554.9
【相关文献】
1.不同季节高原鼢鼠乳酸脱氢酶活力和同工酶谱 [J], 魏登邦;于红妍;张建梅;王晓君;魏连
2.高原鼢鼠血清乳酸脱氢酶活力及同工酶谱的季节性变化 [J], 李永秀;魏登邦
3.人体精液中乳酸脱氢酶同工酶的相对活力测定及其应用 [J], 谭委民
4.高原鼢鼠、鼠兔及大鼠心肌和骨骼肌乳酸脱氢酶活力及同工酶谱 [J], 魏莲;魏登
邦;王晓君;蔡琦
5.23例急性心肌梗死患者血中乳酸脱氢酶同工酶1活力测定 [J], 费正; 吕红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生活养生-乳酸脱氢酶测定
文章导读我们知道，现实生活中存在着各种各样的的酶，这些酶可以单独作用，也可以相互作用，对我们的人体产生很大的影响，但是相信大家对于酶的测定方法还不是很熟悉吧，不同酶的测定有不同的方式方法，而且方式方法也种类不一，现如今乳酸脱氢酶测定方法成为很多人研究的领域话题，那么到底该如何测定呢，下面就让我们一起来了解一下乳酸脱氢酶测定方法吧。
方法：实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
血清乳酸脱氢酶LDH测定
血清乳酸脱氢酶LDH测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH，LDHNADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活力成正比。
L-乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+3 标本：3.1 病人准备：无特殊。
3.2 类型：血清或EDTA血浆。
3.3 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<8%；15～25℃保存：<2%。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司LDH试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成氯化钾 190mmol/L 试剂1（R1）乳酸62.5mmol/LTris缓冲液 100mmol/L试剂2（R2）NAD+ 30mmol/L Tris缓冲液 100mmol/L 4.1.2试剂准备试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂1 与试剂2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
4.1.5 注意事项试剂中含叠氮钠为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的LDH校准品对自动分析仪进行校准。
4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。
6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。
乳酸脱氢酶测定—速率法(精)
乳酸脱氢酶测定—速率法
xiaobinxuer@
实验目的
熟悉血清乳酸脱氢酶测定（速率法）的原理，
测定参数的设置及酶活性单位的计算
实验原理
乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时
使NAD＋还原为NADH，引起340nm处吸光 度的增加，吸光度的增加速率与样品中LDH 活性成正比。
LDH pH 8.8 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H
实验操作
样本要求:当日空腹采集的无溶血、无乳糜的
血清 试剂配制：取R15ml加R21ml混合即为工作试 剂 半自动生化分析仪测定参数
半自动生化分析仪测定参数
分 析 方 法 速 率 法 速 率 法 波长 温 度 试 剂 空 白 延 迟 时 间 30s 测 量 时 间 45s 因数 样 品 量 uL 试 剂 量 uL 吸 入 量 uL 500 单 位 反 应 方 向 正
430
37 要
4920
20 600
U/L
430
37
800
U/L
正
计算
0 0. 6. 0 + 2 0. 0 2
参考范围:104-205U/L 式中6 220为波长340nm处NADH的摩尔 吸光度。
方法评价
1.L-P反应速率法是根据正向反应而建立，其优点在
于：乳酸盐和底物溶液的稳定性较好，－20℃保存 可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的 影响最小。 2.线性范围较宽 本法在LDH活性为726U/L以内时 线性良好。超过此值最好将标本稀释后再测。 3.精密度好 LDH活性为65U/L时，日间CV为5.8%； LDH活性为149U/L时，日间CV为3.2%。 4.特异性高 由于血清中非LDH的NAD＋类氧化还原 酶的内源性底物很少，加上样本的高度稀释，因此， 这些酶的干扰作用可忽略不计。
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。
LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。
由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。
（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。
某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。
此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。
300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。
因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。
血清溶血可使测定值增高，应予以注意。
500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。
三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
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LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外 分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通 过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活 力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液， 观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则 LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下 A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组 织中LDH单位。定量测定蛋白质 3）数据处理 计算每毫升组织提取液中LDH活力单位： LDH活力（U）/mL =
提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml 总体 积
实验6乳酸脱氢酶的活性测定
1、任务背景 乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属 于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最 高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中 也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比 例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转 录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。 不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生 活周期均有其特异性的同工酶酶谱。 2、任务目标 ①掌握LDH活性测定原理； ②学习用比色法测定酶活性的方法。 3、工作原理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH， EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细 胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。
实验步骤
2）LDH活力测定 取1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓 冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。
取1只比色杯，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加 盖摇匀后。加入经稀释的酶液10μl，加盖摇匀后，在A340nm，连续 测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算 A340nm/min减少值。 注意：加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值 在0.1－0.2之间。
利用上述原理，改变不同基质液可测定相应脱氢酶反应过程中 A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛 脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。
实验步骤
1）制备肌肉匀浆 称取1g 鸡肌肉, 剪碎，置10ml离心管中，编号；加入 4℃预冷的0.01 mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾 缓冲液4ml；匀浆，每次10s，连续3次。放置10min， 3000r/min，离心5min。