乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)活性测定试剂盒说明书
乙醇脱氢酶_ADH_产酶菌株的选育_问清江
作者简介：问清江男，副研究员。
主要从事发酵技术研究。
E-mail ：mujuan2008@163．com *通讯作者。
女，研究员。
主要从事酶学在医学、食品、农业及环保领域应用研究。
E-mail ：mujuan2007@163．com 收稿日期：2013-03-13；修回日期：2013-05-08乙醇脱氢酶（ADH ）产酶菌株的选育问清江1，慕娟1*，党永1，张烁2，景振龙2，贺聪莹3，颜阳欣2（1．陕西省微生物研究所，陕西西安710043；2．长安大学环境科学与工程学院，陕西西安710064；3．西北大学生命科学院，陕西西安710068）摘要从食醋生产企业的醋醅中采集样品，以乙醇为唯一碳源，用碳酸钙透明圈平板法分离出185株菌株，然后以产酸量和耐乙醇能力为标准，摇瓶发酵选育出20株ADH 产酶菌株;A5-2产酸量为49．85g /L ，耐乙醇能力强，A5-2的菌种形态学和16S rDNA 序列分析初步鉴定为巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus );A5-2乙醇脱氢酶酶学性质研究表明:最适作用温度和pH 分别为45ħ和pH 4．0，具有一定的耐热性和良好的耐酸碱性;A5-2乙醇脱氢酶粗酶制备条件为硫酸铵饱和度70% 80%，回收率84%。
关键词乙醇脱氢酶;醋酸杆菌;选育;酶学性质中图分类号Q935文献标识码A文章编号1005－7021(2013)05－0054－06doi :10．3969/j．issn．1005－7021．2013．05．010Breeding of Alcohol Dehydrogenase Producing StrainsWEN Qing-jiang 1，MU Juan 1，DANG Yong 1，ZHANG Shuo 2，JING Zhen-long 2，HE Cong-ying 3，YAN Yang-xin 2（1．Shaanxi Inst．of Microbiol．，Xi'an 710043；2．Coll．Environ．Sci．＆Engin．，Changan Uni．，Xi'an 710064；3．Coll．of Life Sci．，NW Uni．，Xi'an 710068）Abstract 185alcohol dehydrogenase （ADH ）producing strains were isolated from samples collected from vinegar fermented grains in vinegar production enterprise by selective medium using ethanol as the sole carbon source ，and calcium carbonate transparent circle on plate．20high ADH producing strains were bred under shaking-flask fermenta-tion ，in which acid output and ethanol tolerance were used as standards．The acid output of A5-2achieved 49．85g /L and its capacity of ethanol tolerance was strong．A5-2was initially identified as Acetobacter pasteurianus based on its morphological characterization and 16S rDNA sequence．Study on enzyme characteristics showed that the optimal reac-tion conditions of A5-2ADH were at 45ħand pH 4．0，and it had heat tolerance and fine tolerance against acid-base．The preparation condition of crude ADH were saturated concentration of ammonium sulfate was at 70% 80%and the ADH activity recovery was at 84%．Keywordsalcohol dehydrogenase （ADH ）；Acetobacter ；breeding ；enzymological characteristics乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase ，ADH ）广泛存在于人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物细胞中，是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，其为具有广泛专一性的含锌金属酶，以NAD +为辅酶，能够催化乙醇氧化为乙醛，乙醛经乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase ，ALDH ）继续氧化生成乙酸，进入三羧酸循环最终生成二氧化碳和水，是人和动物体内重要的代谢酶。
乙醇脱氢酶法测定血浆中乙醇
乙醇脱氢酶法测定血浆中乙醇西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2005Oct.;26(5)345乙醇脱氢酶法测定血浆中乙醇伏建峰,史清海,路西春,高华,丁艳萍(兰州军区乌鲁木齐总医院,新疆乌鲁木齐830000)论着?摘要:目的:建立一种快速测定血浆中乙醇浓度的新方法.方法:选用三(羟甲基)氨基甲烷一盐酸(Tris—HCL)作为缓冲体系,在碱性条件下,乙醇脱氢酶(ADH)催化乙醇转化成乙醛,同时生成还原型辅酶I(NADH).在340Bill波长处检测吸光度的变化,对照标准计算乙醇的浓度.结果:ADH最适用量为753KU/L,辅酶I(NAD)最适浓度为60.0mmol/L,检测过程仅需90s,线性范围可达0～68.60mmol/L,变异系数(CV)为2.31%～3.25%,回收率为98.4%～101%,与美国DADE试剂盒比较具有良好的相关,^y:0.985,Y=0.987x+0.024.结论:本法测定血浆中乙醇无需除蛋白,具有快速,简便等优点,可用于自动生化分析仪及手工操作,适于临床常规运用.关键词:实验室诊断;乙醇;乙醇脱氢酶;检测;临床应用中图分类号:R446.1文献标识码:A文章编号:1o07—8622(2005)05—0345—03 Determinationofalcoholinplasmabyalcoholdehydrogenasemethod FUJian—feng,SHIQing—hai,LUXi—chun,eta1.(UrumchiGeneralHospitalofLanzhouCommand,PLA,830000,China)Abstract:0bjective:Toestablishanewmethodforrapidmeasuringalcohol(ALC)inplasma. Methods:(hydroxymethy1)aminomethane—hydrochloride(Tris—HCL)burwasusedinthisstudy.Intheconditionofalkalescence,alcoholdehydrogenase(ADH)catalyzedtheoxidationofALCtoacetaldehyd e,withthesimultaneous productionofdeoxidizednicotinamideadeninedinucleotide(NADH).Thevarianceofabsor bancewasdeterminedbyafilterof340nm.TheconcentrationofALCwascalculatedaccordingtothestandard.Resul ts:ThemostadaptquantityofADHwas753KU/L.andthebestconcentrationoftheNADwas60.0mmoL/L.Itco stonly90Sinthewholereaction.Therangeoflinearitywasfromzeroto68.60mmo1/L.Thecoemcientofva riationfCVindifferentconcentrationswasfrom2.31%to3.25%.Therecoveryraterangedfrom98.4%to10 1%.ComparedwithDADE(America)reagentsmethod,theregressionequationwasobtained.Conclusion: ThisADHmethodfor measuringtheconcentrationofALCinplasmaisrapidandsimplewithoutremovingprotein.I tcouldbeusedboth automaticallyandmanuallyandsuitableforclinicalapplication.Keywords:Laboratorydiagnosis;Alcohol;Alcoholdehydrogenase;Testing;Clinicalappli cation饮酒过量可引起以神经精神症状为主的疾病,称为酒精中毒(alcoholpoisoning)或乙醇中毒(etha.nolpoisoning)….一次饮用大量酒类饮料会对中枢神经系统产生先兴奋后抑制作用,重度中毒可使呼吸,心跳抑制而死亡.鉴于酒精中毒的后果严重,所以迅速测定血浆中乙醇浓度,对早期诊断和处理急性酒精中毒具有非常重要的f临床价值.作者报道一种新的酶终点法测定血浆中乙醇浓度,无需除蛋白,收稿日期:2005—06—23作者简介:伏建峰(1967一),男,副主任技师,Tel:0991—4992736, Email:****************整个检测过程仅需90S,可用于自动生化分析仪及手工操作,适于临床常规运用.1原理选用三(羟甲基)氨基甲烷一盐酸(s—HCL)作为缓冲体系,在碱性条件下,乙醇脱氢酶(ADH)催化乙醇转化成乙醛,同时生成还原型辅酶I(NADH).在340nm波长处检测吸光度的变化,对照标准计算乙醇的浓度.2材料与方法2.1试剂:ADH,辅酶I(NAD)为Sigma产品,三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)为国产分析纯.试剂I:346西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2005Oct.;26(5)ADH16.8mg溶于10ml重蒸水.试剂II:NAD238.8mg溶于6ml重蒸水.试剂III:Tris10.70g溶于1O0ml重蒸水,检{贝0前与0.1mol/LHCL按5:1(V/V)混合.2.2标准液:分别加入100,200,300和400Ixl无水乙醇到50ml蒸馏水中,制备出的标准液浓度分别为17.15,34.30,51.45和68.60mmol/L,储存于具塞容器中备用.2.3混合血浆制备:采集40位健康体检者肘部静脉血各2ml,NaF抗凝,离心后制备混合血浆.2.4标准血浆:分别加入20,40,60,80l无水乙醇到10ml混合血浆中,混匀.制备出的标准血浆浓度分别为17.15,34.30,51.45和68.60mmol/L,以1m1分装,一20~C储存备用.2.5仪器:XL型生化分析仪(美国杜邦).2.6自动分析参数:反应类型:终点法;反应温度:37~C;波长:340nm(主)/380nm(次);样品3l,试剂I25l,试剂II130Ixl,试剂III340Ixl;反应时间:90s.3实验与结果3.1ADH用量的选择:取ADH(单位:KU/L)活性分别为:27,54,108,215,323,430,538,645,753,860,968的酶工作液分别测定高浓度(51.45retool/ L)的乙醇标准液,图1结果表明,ADH用量在753 KU/L以上最适.3.2NAD浓度选择:在pH10.5,ADH为753KU/L条件下,观察NAD浓度(mmol/L)为10,20,30,40,5O,6O,7O,8O,9O时对反应进程的影响,NAD最适浓度为60.0retool/L.3.3缓冲体系的选择:配制pH9～11的各种缓冲液:甘氨酸一NaOH,KH2PO4一K2HPO4,Na2CO3一NaHCO和Tris—Hcl等,在相同条件下,观察其对反应进程的影响,riffs—Hcl较为适宜.3.4缓冲液浓度及pH的选择:分别配制pH为:8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0的Tris—Hcl溶液,结果显示pHlO.5时较为适宜,同时确定Tris浓度为882.9mmoL/L.3.5反应动力学曲线:选择低,中,高(17.15,34.30,68.6mmol/L)三个不同浓度标准血浆,用本法在XL上观察反应进程,图2结果表明,不同浓度的样品60s内吸光度上升最快,70～80s曲线平缓, 90s后吸光度基本一致,因此选择90s为反应终点时间图2ADH法检测三个不同乙醇浓度标准血浆反应进程曲线3.6线性范围:取浓度为0,17.15,34.30,51.45,68.60mmol/L的标准血浆用本法测定,乙醇在0～68.60rnmol/L范围内线性良好.3.7精密度试验:选择低,中,高(17.15,34.30,51.45mmol/L)三个不同浓度标准血浆,用本法重复测定20次,批内变异系数分别为3.25%,2.31%和2.40%.3.8回收试验::在已知乙醇浓度为20,0rnmol/L的标本内分别加入低,中,高三种浓度(17,15,34.30,51.45rnmol/L)的乙醇标准液,回收率分别为1O0%,101%及98.4%.3.9干扰试验:将同体积蒸馏水和同体积不同浓度的干扰物,分别加入到等体积的混合血浆中,前者为对照样品,其余为含不同浓度干扰物质的检测样品,每个样品重复测定5次,取均值.检测样品与对照样品比较,偏差<±5%,说明该浓度物质对检测无显着干扰.测定结果显示,本法至少能去除30mmol/L的乙醛.此外,胆红素<500ixmol/L,血红蛋白<5g/L,甘油三脂<10.0mmol/L时,测定结果未见明显干扰.3.1O对比试验:选取40份不同乙醇含量的血浆分别用本法与美国DADE试剂盒对比测定,结果经回归分析::0.985,Y:0.987x+0.024.3.1l临床应用:健康体检且无饮酒习惯者40例,清晨空腹采血,用本法测定血浆乙醇含量,结果0西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2005Oct.;26(5)347 mmoL/L36例,0.5～1.5mmoL/IA例;交通管理部门送检疑有酒后驾车者27例,血浆乙醇浓度在l0.8—39.0mmol/L,平均为21.4mmol/L,其中24人最终承认饮过酒;酒后反应迟钝并呕吐者8例,血浆乙醇浓度为20.5～39.7mmol/L;酒后昏迷者3例,血浆乙醇浓度分别为55.2,59.1和62.8mmol/L.4讨论ADH法检测乙醇最早由Hadjiioanno提出并沿用至今,传统方法需除蛋白,且反应时间较长(约300s),由于乙醇极易挥发,很难确保其检测的准确性.本法选择Tris—HCL作为缓冲体系,加之选用高活力的ADH,促使样品中有限的乙醇快速转化成乙醛,整个检测过程仅需90s且不用除蛋白,经方法学评价,各项指标均较为满意:线性范围可达0～68.60mmol/L,变异系数(CV)为2.31%～3.25%,回收率为98.4%～101%,与美国DADE试剂盒比较具有良好的相关.ADH工作环境为碱性,甘氨酸一NaOH,KH2PO4一K2HPO4,Na2CO3一NaHCO3和Tris—Hcl 等缓冲体系均可选用.在我们的实验中,甘氨酸一NaOH,KH2PO一K2HPO缓冲体系不甚理想;Na2CO3一NaHCO3和Tris—Hcl缓冲体系较为理想, 由于Na2CO,一NaHCO,缓冲液容易结晶,不利于存储,作者选择Tris—Hcl作为缓冲体系,该缓冲体系含有两性离子,有利于发挥酶的活力.不同文献报道的ADH的最适pH值也有很大差别,范围大致为8.8～10.9L2"J,可能由试验条件及ADH的来源不同所致,作者所选用ADH来自酵母,在本试验条件下,ADH的最适pH值为l0.5.乙醛是乙醇的氧化产物,其产量增多可抑制ADH的活性,试验中当乙醛浓度达30.0mmol/L时,仍未见其对ADH有明显的抑制作用,推测可能是s—Hcl和乙醛结合生成一种复合物,且此反应不可逆,使乙醛迅速被移走,反应得以快速进行.酶法自动分析已经普及,血中乙醇的酶学测定法分为两种:乙醇氧化酶法和ADH法.乙醇氧化酶法的试剂组成简单,缺点是特异性差,甲醇对测定干扰很大,可出现假阳性.ADH法相对特异,受甲醇或异丙醇的干扰极小,此外ADH较乙醇氧化酶更易得到且成本较低,因此ADH法更适宜常规操作,易于推广应用.参考文献:[1]BishopML,Duben—EngelkirkJL,FodyEP.Clinical chemistry[M].FourthEdition,PhiladelphiaUSA:Lippin. cottWilliamsWilkins,2000.508—610.[2]胡建强,刘凤兰.血清乙醇脱氢酶活性测定及其临床应用[J].天津医科大学学报,2001,7(1):110—111.[3]陈金来,刘毅,郭妹,等.酶法血清乙醇测定试剂盒的初步评价及临床意义[J].天津医科大学学报,2002,8 (4):506—508.[4]1wamotoR,KubotaH,HosokiT,eta/.Completeaminoacid sequenceandcharacterizationofthereactionmechanismofa glucosamine—inducednovelalcoholdehydrogenasefrom Agrobacteriumradiobacter(tumefaciens)[J].ArchBio. chemBiophys,2002,398(2):203—212.[5]张红霞,邓振华,谢娜,等.酒后驾车血液呼气中乙醇检测方法评价[J].刑事技术,2003,5:36—39.《西北国防医学杂志》征订启事<西北国防医学杂志=》为兰州军区联勤部卫生部主办的国,内外公开发行的综合性医药卫生学术性期刊,是"中国科技论文统计源"期刊,已被<中国科学引文数据库》等国内重要数据库收录,也被美国化学文摘(CA)和俄罗斯文摘杂志(JA)收录,刊出省部级以上各类基金资助论文及获奖论文占有较高比例,多次在军内外期刊质量评比中获奖.本刊刊登军内外医务工作者有关基础医学,临床医学,军事医学,文献综述,讲座,护理,卫生科技管理等方面的学术文章.主要栏目有:述评,论着,临床研究,高原医学,经验交流,护理,综述,讲座,卫生行政等.我们希望本刊能对广大医务工作者有所裨益,并热切欢迎对我刊给予扶持和指导.<西北国防医学杂志》(前身为<兰后卫生=》),1979年创刊,2002年改为双月刊,大16开本,80页,逢双月末出版,每期定价10.0o元.<西北国防医学杂志>国内邮发代号54—101,欢迎在当地邮局订阅,也可直接向编辑部订阅,全年70.0o元(含邮费).编辑部地址:兰州市小西湖西街98号;邮政编码:730050联系电话:(0931)8975420;E—mail:************。
人乙醛脱氢酶(ALDH)说明书
人乙醛脱氢酶（ALDH)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，组织及相关液体样本中乙醛脱氢酶（ALDH)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人乙醛脱氢酶（ALDH)水平。
用纯化的人乙醛脱氢酶（ALDH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙醛脱氢酶（ALDH)，再与HRP标记的乙醛脱氢酶（ALDH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的乙醛脱氢酶（ALDH)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人乙醛脱氢酶（ALDH)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：90ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
细菌乙醇脱氢酶总活性光度法定量检测试剂盒产品说明书(中
细菌乙醇脱氢酶总活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌乙醇脱氢酶总活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过检测反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原后峰值的增高，即采用光度法来测定细菌裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种细菌菌株裂解悬液样品乙醇脱氢酶的总活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase；ADH；EC1.1.1.1），又称为乙醇NAD氧化还原酶（alcohol NAD- oxidoreductase），属于氧化还原酶家属成员之一，是一组含有6个亚酶的催化乙醇氧化的锌依赖性金属酶蛋白。
存在于许多生物体中。
通过氧化原发性和继发性醇类分子和半缩醛（hemiacetals），转化产生乙醛或酮。
乙醇脱氢酶分成三类：一类为辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）或辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP）依赖型；一类为吡咯喹啉醌-，血红素基团、F420（Pyrroloquinoline quinone，haem group，F420）依赖型；一类为黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide）依赖型。
NAD或NADP依赖型乙醇脱氢酶又可以分成三种：一种为锌依赖性的中长链型（350氨基酸残基）；一种为锌非依赖性的短链型（250氨基酸残基）；一种为铁激活性（385氨基酸残基）。
在微生物中，乙醇脱氢酶起着发酵功能。
且用于酒精性饮料、工业溶剂、醋的生产，参与外源性芳香族化合物（xenobiotic aromatic compounds ）的降解，帮助细菌或酵母在甲醇环境中生长。
基于底物乙醇，在乙醇脱氢酶的作用下，转化为乙醛（aldehyde）产物后，通过测定反应体系中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）的变化（340nm 波长），来定量分析乙醇脱氢酶的总活性。
酒精脱氢酶表达
酒精脱氢酶表达
酒精脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）是一种酶类蛋白质，能够催化酒精在生物体内的代谢过程。
ADH的表达水平受到多种因素的影响，包括基因表达、环境因素、药物等。
在基因层面，ADH的表达受到ADH基因本身的调控，以及其他相关基因的影响。
例如，ADH基因的表达受到转录因子的调控，如NF-κB、AP-1等。
此外，环境因素如温度、pH值、氧气浓度等也会影响ADH的表达。
在药物层面，某些药物可以影响ADH的表达。
例如，酒精、乙醇等物质可以刺激ADH的表达，而一些药物如丙磺舒、丙磺舒利福平、丙磺舒利福定等则可以抑制ADH的表达。
总之，酒精脱氢酶的表达受到多种因素的影响，需要综合考虑多种因素来确定其表达水平。
乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)
乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)简介：乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)的系统名为乙醇：辅酶I氧化还原酶（alcohol：NAD+oxidoreductase），大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。
乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应：CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+ H+。
在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参乙醇脱氢酶与体内乙醇代谢，是人和动物体内重要的代谢酶。
作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，它在很多生理过程中起着重要作用。
丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醇脱氢酶(ADH)是乙醇发酵途径的关键酶，无氧呼吸途径代谢产物的过程积累对细胞产生毒性，影响线粒体结构和三羧酸循环的相关酶活性。
Leagene乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)检测原理是在弱碱条件下，以乙醛为底物，乙醛在ADH催化下被NADH还原为乙醇，ADH每催化1分子乙醛消耗1分子NADH，通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出乙醇脱氢酶活性水平。
该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中乙醇脱氢酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、研钵或匀浆器2、离心管或试管3、低温离心机4、96孔板5、酶标仪编号名称TE0471100TStorage试剂(A):ADH Lysis buffer250ml4℃避光试剂(B):PMSF1ml-20℃试剂(C):ADH Assay buffer20ml RT试剂(D):NADH1支-20℃使用说明书1份操作步骤(仅供参考)：1、配制ADH Lysis buffer工作液：取出ADH Lysis buffer和PMSF，恢复至室温，ADHLysis buffer：PMSF按一定比例混合，混匀，即配即用，不易久置，否则蛋白酶抑制剂PMSF的效率会有所下降。
乙醛脱氢酶测定方法
乙醛脱氢酶测定方法
需要注意的是，具体的实验步骤和条件可能因实验目的、样品类型和实验室设备而有所不 同。在进行乙醛脱氢酶测定前，应参考相关的步骤： 1. 准备一组试管，每个试管中加入以下试剂（体积可根据需要调整）： - 0.1 M 磷酸盐缓冲液 1 mL - 0.1 M 乙醛溶液 0.1 mL - 待测样品 0.1 mL（如果有） 2. 在每个试管中加入适量的乙醛脱氢酶溶液，使最终体积为2 mL。 3. 在每个试管中加入适量的NAD+溶液，使最终体积为3 mL。 4. 将试管放入37°C的恒温水浴中，孵育一定时间（通常为10-30分钟）。
乙醛脱氢酶测定方法
5. 孵育结束后，使用分光光度计测量每个试管中的吸光度。乙醛脱氢酶催化乙醛氧化生 成乙酸，同时还伴随着NAD+还原为NADH。通过测量NADH的吸光度变化，可以间接测定 乙醛脱氢酶的活性。
6. 使用一个空白试管作为对照，其中不加入乙醛溶液，其他步骤相同。
3. 数据分析： - 计算每个试管的吸光度差值（样品试管减去空白试管）。 - 根据已知的标准曲线或对照样品，将吸光度差值转换为乙醛脱氢酶的活性。
乙醛脱氢酶测定方法
乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是一种酶，主要参与乙醛的代谢过程 。以下是一种常用的乙醛脱氢酶测定方法：
1. 材料准备： - 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4） - 0.1 M 乙醛溶液 - 0.1 M NAD+（辅酶）溶液 - 待测样品
乙醛脱氢酶测定方法
酵母醇脱氢酶实验报告
0.1
0.079
0.05
0.037
0
0
0
0.1
0.2
结合标准曲线数据整理结果为：
y
0.187 0.3
0.241 0.4
2015 年 3 月-6 月 0.275
0.5
0.6
结论：最终酶制剂的比活力提高了四倍多，提纯确实有效。
8
南京大学生科院 13 级
酵母醇脱氢酶的相关研究
2015 年 3 月-6 月
结论：有酶活力的是 6 号管。酶活力为 11.5U，比活力为 284U。比 活力又有一些提高，层析有些效果。
11
南京大学生科院 13 级
酵母醇脱氢酶的相关研究
2015 年 3 月-6 月
实验三：酵母醇脱氢酶的专一性
一、目的
了解醇脱氢酶的专一性。
二、原理
用不同的醇(乙醇、正丙醇、甲醇)作底物，观察醇脱氢酶的专一性。 反应方程式:
5、收集与侧定 用部分收集器收集洗脱液，每管 4m1.紫外检侧仪 280 处检测。记录吸收值，绘 制洗脱曲线. 本实验在用 280nm 检侧的同时需测定酶的活力大小，收集 280nm 峰和活力峰 重叠的区域.将收集液反复冷冻干燥得纯的酵母醇脱氢酶，用实验二的方法测定酶 的比活力.
六、结果
实验数据记录如下图：
醇脱氢酶的辅酶 NAD 它能催化乙醇脱氢变为乙醛，脱下的氢则使 NAD+还原. 当有过量醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活成正比，酶活力越高，单位时间产 生的 NADH 越多.NADH 对 340nm 紫外线有较强的吸收. NAD+无此能力.因此可用 测定 A340 的方法测得反应体系中 NADH 含量，从而得知酶活力的大小。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
货号: QS1007 规格：50管/48样乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性测定试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。
哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。
血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
测定原理：
ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。
自备实验用品及仪器：
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1瓶，室温保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
临用前把试剂三转移到试剂二中，4℃保存。
试剂三：粉剂×1支，－20℃保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，
加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。
2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500
万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。
3、血清等液体：直接测定。
ADH测定操作：
1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在25℃水浴中保温30 min。
3. 空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂二和100μL试剂四，
迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。
△A空白管=A1-A2。
4. 测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL试剂二和100μL试剂四，
迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。
△A测定管=A3-A4。
注意：空白管只需测定一次。
计算公式：
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH 为1个酶活单位。
第1页，共2页
ADH (μmol/min/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T
=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (μmol/min/g鲜重) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷(W×V样÷V 样总)÷T
=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (μmol/min/104cell) = [(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷(细胞数量
×V样÷V样总)÷T
=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化1μmol NADH 为1个酶活单位。
ADH (μmol/min/mL) = [(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷V样÷T
=1.61×(△A测定管–△A空白管)
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1 mL；T：反应时间，1min。
注意事项：
1.上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
2.配制好的试剂二3天使用完。
第2页，共2页。