基因工程考试题目整理

1.如何区分重组DNA和空载体自连：

（一）检测方法

（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。

（2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。

（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。（抗生素+酶切检测+测序）

（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。以X-gal作为指示剂。若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。

（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定

（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。

（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。

（8）基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。

（二）避免方法：

（1）. 碱性磷酸酶处理载体在DNA重组实验中，用碱性磷酸酶对载体DNA的5’末端除磷，可以防止载体自连，提高重组率

（2）. 噬菌体包装蛋白包装下限的限制：选用λ噬菌体或者柯氏载体，含有cos位点，包装35~51kb的片段，空载体片段太小，不会被包装

（3）. 利用某些基因(改基因存在时质粒不能在一定的菌株中存在,而此被基因为外源DNA取代时则能存在)等预防措施.

2.如何在大肠杆菌中高效表达外源基因：

涉及三个方面：

（1）强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；

（2）抑制蛋白质产物降解；

（3)恢复维持蛋白质特异性空间结构。

（一）．强化蛋白质的生物合成

1）启动子：影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度。

高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：

（1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10％-30％；

（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。

2）终止子：有效的转录终止子的必要性：

（1）转录产物越长，所需时间就多，外源基因本身的转录效率下降；

（2）转录通读进入质粒功能区，可能干扰质粒的复制和其他生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；

（3）转录终止子能增强mRNA分子的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平；

（4）转录产物过长影响翻译效率。

3）核糖体结合位点（RBS）的结构要素：外源基因在大肠杆菌中的高效表达不仅取决于转录启动频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌mRNA的翻译起始效率主要由其5‵端的结构序列所决定，即核糖体结合位点（RBS），它包括4个结构要素：

（1）起始密码子上游的6-8个核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno (SD)序列；

（2）起始密码子AUG；

（3）SD与起始密码子之间的距离及碱基组成；

（4）基因编码区5‵端若干密码子的碱基序列，至少这一序列不能与mRNA的5‵端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。

4）密码子由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：

（1），采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子；

（2）对于那些含有不和谐密码子种类单一，出现频率较高而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。

5）质粒拷贝数可以通过构建高拷贝载体增加质粒拷贝数以增加基因的剂量。质粒的稳定性对工程菌株高效表达产物非常重要。在寄主细胞快速生长期间质粒易于丢失，出现无质粒细胞。

减少质粒丢失的措施：

（1）保持抗生素的选择压力；

（2）在载体中保留或连接质粒分配功能区bar；

（3）避免质粒多体的形成；

（4）将重组质粒的扩增纳入可控制轨道。

(5)对于分子量较小的蛋白或多肽可采用将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因克隆在高拷贝载体上表达的策略。

二)．抑制蛋白质产物降解

1）包涵体异源蛋白的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的蛋白质常形成包涵体，包涵体是由一群不溶性蛋白质聚集在一起形成的晶体结构物，被膜包裹或无膜裸露。大肠杆菌形成的包涵体大部分存在于细胞质中。以包涵体形式表达异源蛋白的优点：

（1）易于分离；

（2）蛋白质受到保护而免受胞内蛋白酶的降解；

（3）蛋白质没有生物活性，对寄主细胞没有影响。

2）分泌型异源蛋白的表达这种蛋白质分泌定位于细胞周质，或分泌到胞外培养基中。

优点: (1)易于纯化，因为周质和胞外的蛋白质种类较少；

（2）蛋白酶活性较低，蛋白质较稳定；

（3）N端甲硫氨酸残基被切除。

3）融合型异源蛋白的表达将外源基因和受体菌自身蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个阅读框架进行表达，这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白质。

优点：（1）位于融合蛋白的N端受体菌自身蛋白质可使蛋白质产物稳定性增加，阻止包涵体地形成；

（2）分离纯化程序简单；

（3）表达效率高。在构建融合蛋白表达系统时，所选用地受体菌基因通常是高效表达的。

三)．恢复维持蛋白质特异性空间结构

将表达出来的蛋白质在体外加工使其拥有正确的空间构象。

例如（1）在生产胰岛素时，或者分别表达A/B链，在体外进行二硫键连接；

或者（2）表达前胰岛素蛋白，在体外进行酶切。

3.逆转录病毒法

逆转录病毒法是将外源目的基因和逆转录病毒载体重组，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的。携带外源基因的反转录病毒DNA依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异性核苷酸序列可以整合到宿主染色体上，经过杂交筛选即可获得含有目的基因的动物。

优点：操作简便、可大量感染细胞、形成单拷贝和高转化率（可达100％）

缺点：病毒载体可能从整合位点上脱落，恢复病毒特性，对宿主细胞的功能造成影响，甚至使动物死亡。逆转录病毒载体容纳外源基因的DNA片段较小（≤10kb），而且获得的子代动物嵌合体的比例大。

4.基因工程用到的各种酶

（1）DNA聚合酶：

①识别序列为4、5或6个碱基对且具有180 旋转对称的回文结构

②同位酶：识别相同的序列但切点不同。如 XmaI/SmaI

同尾酶：识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。

同裂酶：识别位点和切割位点均相同的酶。如 HpaI/HincII

③一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低；不同生物碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。

④切开的DNA末端有平头末端和粘性末端（双链DNA的一条链突出，如5′或 3′突出末端，在适当的温度下，两个互补粘性末端能退火形成双链分子。

Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。

DNA聚合酶以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3ˊ-OH端而合成新的DNA。大肠杆菌DNA PolymeraseI研究得较清楚，单体，具有5′- 3′的DNA聚合活性， 5′- 3′的DNA外切活性和3′- 5′的DNA外切活性。用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ产生两个片段，一个小片段，带有的5ˊ - 3ˊDNA外切酶活性，而另一个较大的片段失去了5ˊ - 3ˊDNA外切酶活性但保留了另两种活性5ˊ - 3ˊ聚合酶活性3ˊ - 5ˊ外切酶活性，这个大片段被称为Klenow大片段酶。

（2） DNA 连接酶

DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸基团共价结合形成3′-5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来，因此它在DNA复制，修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。

大肠杆菌连接酶是利用NAD+作为能源的，而T4噬菌体DNA连接酶则是以ATP作为辅助因子。

（3）碱性磷酸酶

细菌的碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠的碱性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5‘端除磷反应，因此在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5′末端除磷操作以防止载体自身连接，提高重组效率；用于末端标记。

（4）末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）

该酶来源于小牛胸腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3′游离羟基的双链DNA分子,当底物为3’端突出的双链DNA时，TdT在Mg2+的存在下，即可将脱氧核苷酸随机聚合在两条链的3′端，对于平头或3′凹端DNA底物，则需要Co激活，但聚合反应仍不按模板要求进行.TdT在人工粘性末端的构建中极为有用。

（5）核酸酶 S1核酸酶(S1,Nuclease)

该酶来源于米曲霉茵，催化反应通常由Zn 2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）条件下进行，其特征是：（1）降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度；（2）降解反应的方式为内切和外切；(3)酶量过大时会伴有双链核酸的降解。因为该酶的双链降解活性比单链低7.5万倍，因此在DNA重组及分子生物学研究中，S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1图谱。

5.基因文库

基因文库（gene library)或DNA文库：在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA（或来自所有不同的mRNA种的每一种cDNA分子）所形成的的全部DNA片段之集合体。有基因组DNA文库(克隆)和cDNA文库(克隆)。

基因组DNA克隆(文库）某种生物总基因组DNA片段和某一载体形成的克隆或文库。

cDNA克隆文库来自某一生物的某种组织的所有不同的mRNA合成的cDNA分子再将cDNA重组到载体上，导入大肠肝菌细胞增殖。

基因组DNA文库构建

①载体DNA片段的制备

DNA分离纯化→限制酶切→脱磷酸化反应

②供体DNA片段的制备

总DNA分离纯化→物理切割法或机械搅拌或限制性核酸内切酶酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化，可得到10-30kb的随机片段）→分离特定大小DNA片段

③ DNA片段大小分离和富集

琼脂糖凝胶电泳和蔗糖梯度离心技术

④载体与基因组DNA大片段的连接

cDNA文库的构建

A、分离总RNA，然后从中纯化mRNA。

B、合成第一cDNA链。

C、将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。

D、将合成的双链cDNA重组到载体上，导入大肠肝菌

细胞增殖。

构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。

基因文库可以构建所需的目的基因,并且不含有其他基因.一般母目的基因都很小,直接提取的话会含有很多其他片段的基因,难以将他们分离开来

6.植物转基因技术的基本路线

1）分离能够编码所需产物的DNA片段（目的基因）。

2）将目的基因克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，并且连

接了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的

基因转录终止终止子，还连接了一个编码特殊性质的蛋白

质（如荧光蛋白）标记基因。

3）利用细菌繁殖扩增重组DNA。

4）利用基因枪、农杆菌等方法将连接了启动子和终止子的目

的基因导入到目标植物的细胞中。

5）筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株。

6）转基因植株大规模种植。

7.高等生物基因克隆方案（动物）

转基因动物的关键技术包括：(1)外源目的基因的分离 (基因的克隆及重组DNA的制备等)；(2)外源目的基因与专性基因表达起动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组；(3)外源目的基因重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞；(4)胚胎移植技术 (Embryo Transfer，ET)；(5)转基因胚胎发育生长鉴定及筛选转基因动物品系；（6）目的基因整合率及表达效率的检测。在这些程序中最重要的方法是成功地把外源目的基因转入动物早期胚胎细胞中。2）体细胞核移植法

将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体，通过显微操作或电融合使核供体与相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞）不经过有性繁殖过程，在体外直接进行重组融合，对重组的胚进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物。

3）显微注射法

在显微操作仪下用极细的微吸管将在体外构建的外源目的基因注射到处于原核时期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。

4）胚胎干细胞法

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团（inner cell mass，ICM）中分离出来的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，在适当的环境条件下可形成胚系集落。将外源目的基因转移到ES细胞中，外源基因整合到ES细胞的基因组中，把ES细胞移入胚泡期的胚胎，再把这样的胚胎移植到假孕的代孕子宫内发育，产生出嵌合体动物，进一步获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。

5）精子载体法

它是直接用精子作为外源DNA的载体，精子直接与外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。

总体看来，仍不是十分理想，效率较低。显微注射法是最常用和获得转基因动物最多的经典方法；

反转录病毒载体法在禽类基因转移上应用较多，效果较好；经膜处理精子胞浆微注射法结合了原核微注射和精子载体法各自的长处；ES细胞介导法是和基因定位整合相结合的方法，可以克服外源基因随机整合所带来的一些弊端，而且可在体外条件下对外源基因的表达进行筛选。

8.三大基因编辑系统

TALEN（transcription activator-like effector nuclease）原理：通过 DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复（HDR）或非同源末端连接途径（NHEJ）修复过程完成特定序列的插入（或倒置）、删失及基因融合

ZFN原理：锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）又名锌指蛋白核酸酶（ZFPN），它是一类人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA结合域（zinc finger DNA-binding domain）与限制性内切酶的DNA切割域（DNA cleavage domain）融合而成。研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。此外，通过将锌指核酸酶技术和胞内DNA修复机制结合起来，研究者还可以自如地在生物体内对基因组进行编辑。

ZFN技术可用于基因组编辑。针对目的基因序列设计并合成ZFN后，使之对DNA进行特异性切割，从而形成DNA双链断裂区（Double-StrandedBreaks,DSB）；通过破坏非同源末端链接（non-homologous end joining, NHEJ）使目的基因失活，或借助同源重组（homologous recombination, HR）等方式完成DNA的修复连接，可以使断裂的DNA 双链重新黏合。

缺点：一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性，甚至引起细胞的凋亡，在细胞内部操作的精确程度和后果都较难预料。

CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas技术使用一段序列特异性向导RNA分子（sequence-specific guide RNA）引导核酸内切酶到靶点处，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas系统的开发为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台。

当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。