血管内皮生长因子受体Flt_1结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究

・论著・基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(39525021);国家“863”高技术研究发展计划基金资助项目;北京市科委及北京市高技术实验室资助项目作者单位:100034北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所生物化学与分子生物学研究室通讯作者:寿成超(电话:010*********,E 2mail :cshou9@ )血管内皮生长因子受体Flt 21结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究雷和田　寿成超　吴健　刘晓颖　何洛文　刘美生　郭琦　姜北海 【摘要】　目的　检测从十二肽库中筛选获得的能与血管内皮细胞生长因子(VEG F )受体Flt 21结合的小肽的生物学活性。

方法　免疫细胞化学方法检测小肽融合蛋白DHFR 2F56/F90与人脐静脉内皮细胞的结合活性;鸡胚尿囊膜血管增生抑制实验检测DHFR 2F56/F90能否抑制鸡胚新生血管形成;裸鼠成瘤实验检测DHFR 2F56/F90对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制;免疫组织化学方法检测DHFR 2F56/F90能否定位于肿瘤组织。

结果　小肽融合蛋白DHFR 2F56/F90能与人脐静脉内皮细胞结合,DHFR 2F56能抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成,且DHFR 2F56能与肿瘤细胞结合,促进肿瘤组织坏死及显著抑制肿瘤生长。

结论　十二肽F56是VEG F 结合Flt 21的有效拮抗剂,具有抑制VEG F 诱导的新生血管形成而抗肿瘤生长和转移的潜在应用前景。

【关键词】　内皮,血管;　受体,生长因子;　肽库;　肿瘤I nhibition of tumor grow th by a peptide fusion protein binding to vascular endothelial grow th factor receptor F lt 21 L EI H etian ,SH OU Chengchao ,WU Jian ,LIU Xiaoying ,HE Luowen ,LIU Meisheng ,G UO Qi ,JIANG Beihai.Peking Univer sity School o f Oncology ,Beijing Institute for Cancer Research ,Beijing 100034,China【Abstract 】　Objective Investigating the bio 2activities of peptides selected from phage display peptide library with vascular endothelial growth factor receptor Flt 21.Methods Activities of DHFR 2F56/F90binding to human ubilial vein endothelial cells were detected by immunocytochemistry ,and the activity of antiangiogenesis was determined with chick embry o chorioallantoric membrane (C AM )assay.Balb/c nude mice were used as m odel to detect the activity of DHFR 2F56/F90on inhibiting tum or growth ,and immunohisto 2chemistry was employed to determine the localization of the DHFR 2F56/F90in tum or.R esults DHFR 2F56/F90can bind to H UVEC ,and DHFR 2F56inhibite angiogenesis in C AM.Meanwhile DHFR 2F56can bind with tum or cells ,induce tum or necrosis and inhibit tum or growth in viv o.Conclusion The peptide F56is an effective antag onist of VEG F binding to Flt 21and has a potent utility in antiangiogenesis and inhibiting tum or growth.【K ey w ords 】　Endothelium ,vascular ;　Receptors ,growth factors ;　Peptide library ;　Neoplasm 新生血管形成在实体瘤迅速生长时起关键作用[1]。

实体瘤长至一定体积后,因缺氧常诱导肿瘤细胞分泌一些促血管形成因子,包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEG F ),刺激宿主血管内皮细胞分裂及诱导新生血管向肿瘤组织延伸[2,3]。

VEG F 在促进肿瘤新生血管形成、肿瘤生长及转移过程中起着重要作用。

抗VEG F 单克隆抗体能抑制肿瘤生长和转移,用反义核苷酸抑制VEG F 的表达,可导致实体瘤缩小[4,5]。

大量研究表明,VEG F 受体K DR/F LK 21是血管内皮细胞增殖所必要的,而VEG F 受体Flt 21(fms 2like tyrosine )是新生血管形成所必需。

Flt 21与VEG F 的亲和力比K DR 高10至100倍[6,7]。

促进肿瘤细胞可溶性Flt 21的表达能抑制实体瘤的生长、抑制转移灶的形成及延长宿主的生存时间[8]。

因此,VEG F 及其受体Flt 21已成为近年通过抗肿瘤血管形成治疗癌症的重要研究靶点。

利用噬菌体肽库技术筛选与靶分子特异结合的活性小肽,是近年用于药物研发的重要手段,并有获得成功的报道,如拮抗整合素与细胞粘附分子结合及VEG F 与受体K DR 结合的小肽的筛选[9,10]。

它们均能通过不同机理抑制肿瘤血管的生成。

我们在既往的工作中以VEG F 受体Flt 21为靶分子,通过生物淘筛(Bio 2panning )从噬菌体展示十二肽库中筛选获得了两个能与Flt 21结合的阳性克隆F56、F90[11]。

为了进一步验证其结合活性,我们根据小肽氨基酸序列合成了相应的核苷酸片段,然后将其构建到二氢叶酸还原酶(DHFR)原核表达载体上,其表达的融合蛋白(DHFR2F56)经检测具有阻断VEG F与Flt21结合、抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成及荷瘤裸鼠的肿瘤生长等生物学活性,具有潜在的临床应用前景。

材料与方法1.材料:人脐带标本取自北京妇产医院,RPMI 1640、胎牛血清与胶原酶Ⅱ来源于GI BC O BR L公司,人源VEG F165购于Sigma公司。

人胃癌803细胞系由本实验室保存提供;DHFR和DHFR2F56/F56由本室制备,电泳纯达90%以上[12];3H2TdR购自中国科学院原子能研究所;种鸡蛋来自北京丰台种鸡场;5周龄雌性BA LB/c裸鼠购于中国医学科学院实验动物所;32氨丙基2三乙氧基甲硅烷(APES)购自北京中山生物技术有限公司,使用时用丙酮1∶50稀释;30% H2O2购自北京中山公司;过氧化物酶缀合链霉亲和素(LABE L)与M U LTI LI NK(针对小鼠、大鼠、兔、豚鼠抗体的生物素化免疫球蛋白)为BioG enex产品;闪烁液(PPO2.0g;POPOP0.25g;二甲苯500ml),D2 Hanks溶液(NaCl8.0g,K Cl0.4g,Na2HPO4・12H2O 0.12g,KH2PO40.06g,无水葡萄糖1.0g,1%酚红2ml,加去离子水至总体积1L)为本室自行配置。

2.免疫细胞化学检测:无菌条件下取新生儿脐带标本,用0.1%胶原酶Ⅱ消化后,离心(800r/min, 10min)收集人脐静脉内皮细胞(H UVEC),用20%胎牛血清(FCS)/RPMI1640悬浮后,移入塑料瓶,置于C O2孵箱中培养(37℃,5%C O2)。

0.04%胰酶/ E DT A消化培养原代脐静脉内皮细胞,待细胞变圆时,用培养液终止消化,悬浮贴壁细胞;计数,按2×104细胞/孔加入48孔培养板中培养24h。

弃掉培养液,用冷丙酮/甲醇(1∶1)固定细胞10min后用P BS浸洗;经用3%H2O2/P BS处理10min,以除去内源性过氧化物酶,10%羊血清/P BS封闭,分别加入二氢叶酸还原酶(DHFR)2F56/F90及DHFR(5μg/ml),37℃,1h后常规加入抗DHFR单克隆抗体为一抗,并按试剂盒说明书依次加入酶标二抗及底物显色液,显微镜下观察,摄影。

3.鸡胚绒毛尿囊膜血管增生抑制实验:把新鲜的授精后鸡蛋在38℃、0.1%新洁尔灭溶液中浸泡2min后,放入37.5℃、60%～70%湿度的孵箱中孵化3d,去掉鸡蛋外壳移入平皿培养;待尿囊膜长至约1cm2时分组加药,每组5个鸡胚,将VEG F165(2μg/L)、DHFR及DHFR2F56/F90溶液18μl(0.8μg/μl)分别滴于直径5mm的玻璃纤维滤膜上,并将其置于绒毛尿囊膜的远心端,早晚各1次连续加药2d,观察结果并摄影记录。

重复2次。

4.裸鼠成瘤抑制实验:从中国医学科学院动物中心购买5周龄的BA LB/c裸鼠12只,在右臀部皮下接种人胃癌MG C803细胞,每只裸鼠接种2×106细胞(0.1ml),接种后第5d,随机分成3组,每组4只,腹腔内分别注射DHFR、DHFR2F56/F90,每次150μg/100μl,隔日给药,共10次。

停药后继续观察30d,期间每隔2d用游标卡尺量瘤的长短径,并按公式1/2×长径×短径2计算瘤块的体积。

30d后,断颈处死裸鼠,摄影记录,并取瘤称重进行统计学分析。

且将瘤块固定于10%的甲醛溶液中,用于后续实验。

5.肿瘤组织观察:将瘤块常规固定,石蜡包埋、切片。

切片经HE染色后显微镜下观察。

6.免疫组织化学检测:用DHFR抗体对上述肿瘤组织切片进行常规免疫组化检测。

结果1.小肽F56、F90与血管内皮细胞结合情况:用细胞组织化学实验表明,DHFR2F56和DHFR2F90均能与脐静脉内皮细胞结合,而DHFR与内皮细胞不结合(图1)。

说明DHFR2F56和DHFR90与内皮细胞的结合是通过小肽实现的。

2.DHFR2F56抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的增生情况:实验结果显示,未经任何处理或经VEG F、经DHFR290(A)和DHFR256(B)和处理的细胞有棕黄色着染,而DHFR处理组细胞(C)未见明显着染　×400图1　免疫细胞化学检测小肽融合蛋白与人脐静脉内皮细胞的结合DHFR 处理的瘤组织血管分布较多(A );DHFR 2F56处理的瘤组织血管较少,且瘤组织坏死较严重(B )×250图5DHFR 2F56促进肿瘤组织坏死DHFR 2F56处理组肿瘤明显小于DHFR 对照组,且肿瘤表面均有坏死形成的发黑干痂图4不同给药组在停药30d后的荷瘤状况图3不同给药组BA LB/c裸鼠肿瘤的生长曲线A 1VEG F 刺激血管增生明显;B 1未作任何处理的鸡胚血管;C 1单纯DHFR对血管无明显影响;D 1DHFR 2F56处理的鸡胚血管分布紊乱和具瘀血现象图2F56抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成　×4DHFR 处理的鸡胚,其毛细血管排列有序;在经VEG F 处理的鸡胚尿囊膜,毛细血管数较其他组明显增多,呈现明显的促血管增生现象;但经DHFR 2F56处理的鸡胚尿囊膜,不仅其毛细血管数量减少,排列紊乱,迂曲变形,并且可见有局部出血现象,说明DHFR 2F56有抑制血管形成及破坏血管的作用,对后者的确机制尚不清楚。