nf-kb入核免疫荧光检测实验记录
EMSA法测定NF-KB操作手册
非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册 本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品目录号 产品名称 包装SIDET001非放射性 NF-KB EMSA36 次结合反应SIDET003非放射性 STAT3 EMSA36 次结合反应SIDET004非放射性 STAT5 EMSA36 次结合反应VER. 3.112005年2月目 录1. 简介 (3)2. 试剂盒包装清单 (3)3. 自备实验材料与仪器 (4)4. DNA/蛋白质结合反应 (4)5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)6. 电转移 (6)7. DNA的交联固定 (6)8. 化学发光反应 (6)9. 化学发光图像显示 (7)10．常见问题 (8)11. 参考文献 (8)12．注意事项 (9)2005© Viagene，All rights reserved.1．简介EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
Viagene公司的非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。
与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。
目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。
ALA-PDT通过NF-kB通路调节巨噬细胞极化状态
第42卷第3期 2021年3月激光杂志L A S E R J O U R N A LVol . 42,No . 3 March , 2021•医用光学•A L A -P D T 通过N F -kB 通路调节巨噬细胞极化状态张文涛，杨伟江，罗杰夫，岑蕊言，杨涛，陈劲奕，谭杨，雷霞陆军军医大学大坪医院，重庆400042摘要：目的：探讨A L A -P D T 对巨噬细胞极化的影响，并探讨相关机制。
方法：采用免疫荧光、P C R 、W B 等试验检测巨噬细胞极化特征蛋白C D 86、CD 206、iN O S 、A R G -l 的表达水平变化，N F -k B 激活-核转运检测试剂、W B 试验检测N F -k B 通路激活情况，W B 试验检测抑制N F -k B 通路后C D 86、iN O S 蛋白表达水平。
结果：免疫荧光、PC R 、W B 实验结果显示，P D T 处理后，巨噬细胞M l 特征蛋白C D 86、iN O S 表达水平增高，M 2特征蛋白表 达水平下降（P<〇. 05)。
N F -k B 激活-核转运检测、W B 实验结果表明P D T 处理后，N F -k B 通路被激活。
给予N F -k B 通路抑制剂处理，P D T 处理后巨噬细胞M l 特征蛋白C D 86、iN O S 表达水平增高现象被抑制。
结论:ALA -P D T 通过激活N F -k B 通路促进巨噬细胞向M l 极化。
关键词：光动力疗法（PDT );巨噬细胞；极化；NF -k B 通路中图分类号：R 454. 2 文献标识码：A doi ：10. 14016/j . cnki . jgzz . 2021. 03. 197AIA-PDT regulates macrophage polarization through the N F-K B pathwayZHANG W entao , YANG W eijiang , LUO Jiefu , CEN Ruiyan , YANG T ao ,CHEN Jinyi,TA N Y ang , LEI XiaD aping H o sp ita l , A rm y M edical U n iversity , C hongqing 400042 , C hinaAbstract ：Objective ： To investigate the effect of ALA-PDT on macrophage polarization and its related mecha nism . Methods ： Immunofluorescence , PCR , W B and other tests were used to detect the expression levels of CD 86, CD 206, iNOS and ARG -1 , NF-kB activation-nuclear transfer detection reagent and WB test were used to detect the activation of NF-kB pathway and the expression levels of CD 86 and iNOS after the inhibition of NF-kB pathway by W B test . Results ： Immunofluorescence , PCR and WB showed that the expression levels of CD 86 and iNOS of M l - characteristic protein in macrophages increased , while the expression levels of M 2-characteristic protein decreased af ter the treatment of PDT ( P <0. 05). The NF-kB activation-nuclear transfer test results showed that the NF-kB path way was activated after the treatment of PDT . After treatment with the NF-kB pathway inhibitor , the expression levels of CD 86 and iNOS of macrophage Ml characteristic proteins were inhibited after PDT treatment . Conclusion ： ALA - PDT can promote macrophage polarization to Ml by activating NF-kB pathway .Key words：photodynamic therapy (PDT )； macrophages ； polarization ； NF-KB pathway性物质原卟啉ix ( Protoporphyrin IX ，PPIX )，经一定波 长光照射后在组织内产生单态氧、氧自由基等氧活性物质，杀伤病变细胞，达到治疗目的[1]。
丙戊酸钠通过激活核因子κB(NF-κB)通路引起大鼠HAPI小胶质细胞炎症反应
细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immun〇l)2021, 37(5) 421.论著.文章编号：1007-8738(2021 )05>0421^06丙戊酸钠通过激活核因子k B(NF-k B)通路引起大鼠HAPI小胶质细胞炎症反应賡爱玲，王岩，兰俊英，杨戎王莎莉*(重庆医科大学基础医学院生理学教研室，重庆400016)[摘要]目的研究丙戊酸钠（VPA)诱发HAPI小胶质细胞炎症反应的可能机制。
方法体外培养大鼠HAPI小胶质细胞，分别给予(0、0.25、0.5、1、2.5、5)mm〇l/L VPA处理24 h。
显微镜观察各组细胞生长及形态变化，CCK-8法检测细胞存活率，ELISA检测各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子a (TNF-ot)的含量。
以2.5 mmol/L VPA作为最适浓度，Western blot法检测核 因子k B抑制物（I k B)激酶a/p( IK K a/p)、磷酸化的I k B激酶(PIK K a/p)、肿瘤坏死因子a (TNF-a〇、白细胞介素1 p(IL-1 p)的蛋白表达，激光共聚焦显微镜技术观察NF-k B p65蛋白核转位情况。
结果随着VPA浓度增高，HAPI细胞逐渐伸出丝状伪 足，并最终激活形成阿米巴样形态，且HAPI细胞的存活率不断降低；当VPA的浓度增高至1mmol/L后，小胶质HAPI细胞分 泌的TNF-a明显高于正常对照组。
2. 5 mmol/L VPA处理的HAPI细胞NF-k B通路相关蛋白IKKa/p、pIKKa/p、TNF-a、IL-1(3表达明显增高，同时伴随HAPI细胞中NF-K B p65蛋白表达由胞质中高表达转为主要在细胞核内表达。
结论高浓度VPA通 过激活HAPI小胶质细胞NF-K B通路，引起炎症反应。
[关键词]丙戊酸钠（VPA); HAPI小胶质细胞；炎症；核因子K B(NF-K B)[中图分类号]R971+.6,R364.5,R392.12 [文献标志码]ASodium valproate induces HAPI microglia inflammatory response in rats by activating NF-k B pathwayLIAO Ailing, W A N G Yan, L A N Junying, Y A N G Rong*, W A N G Shali*D e p a rtm e n t o f P h y s io lo g y, S c h o o l o f B a sic M e d ic a l S c ie n c e s, C h o n g q in g M e d ic a l U n iv e rs ity, C h o n g q in g400016, C h in a* C o rre sp o n d in g a u th o r s, E-m a i l：63557408@q q.c o m；1364262572@q q.c o m[A b s tra c t] Objective To investigate the possible mechanism of scxJium valproate (VPA) inducing HAPI microglia inflammatory response. Methods HAPI microglia were cultured in vitro and treated with VPA of 0,0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 mmol/L for 24 hours. The cell growth and morphological changes in each group were observed under inverted microscope, the cell viability determined by the CCK-8 assay, and the level of tumor necrosis factor a (TN F-a) in the cell culture supernatant of each group measured by ELISA. The protein expressions of I k B kinase a/p(IK K a/p), phosphorylated I k B kinase (p IK K a/p), TNF-a, and interleukin-1 p (IL-ip) were detected by Western blot with 2.5 mmol/L of VPA as the optimal concentration. The nuclear translocation of NF-k B p65 was observed by confocal laser scanning microscopy. Results With the increase of VPA concentration, HAPI cells gradually extended filopodia and finally became activated to form amoeboid microglia, and the viability of HAPI cells decreased continuously；when the concentration of VPA increased to 1mmol/L, the TNF-a secreted by HAPI microglia was significantly higher than that by cells in the normal control group. The expression levels of NF-k B pathway related proteins IKK〇c/(3, pIKKa/p, TNF-a, and IL-ip in HAPI cells treated with 2.5 mmol/L of VPA were significantly increased, and the NF-k B p65 in those HAPI cells was highly expressed in the nucleus rather than in the cytoplasm. Conclusion High concentration of VPA induces HAPI microglia inflammatory response by activating NF-k B pathway.[Key words] sodium valproate (VPA) ；HAPI microglia；inflammation；nuclear factor k B (NF-k B)丙戊酸钠（sodium valproate, V P A)是临床广泛应 伤和胎儿发育异常[~，包括胚胎神经管缺陷，兔唇，用的抗癫痫药物，对神经系统具有保护作用+3]，但 先天性心脏病、自闭症等神经发育障碍疾病[5_7]。
免疫荧光染色实验记录模板
免疫荧光染色实验记录模板
1. 实验日期和实验者信息，记录实验进行的日期和实验人员的姓名或编号，以便追溯实验操作和结果的责任人。
2. 样本信息，包括样本来源、处理方法、处理时间和处理条件等信息。
确保记录样本的处理过程，以便在实验结果出现问题时进行排查。
3. 抗体信息，记录使用的抗体信息，包括抗体的来源、批号、稀释倍数、存储条件等。
这些信息对实验结果的准确性和可重复性非常重要。
4. 染色条件，记录染色的条件，包括染色液的配制方法、染色时间、温度等。
这些条件对实验结果的准确性和可重复性有重要影响。
5. 显微镜观察，记录观察到的样本荧光信号情况，包括荧光强度、分布情况等。
这些观察结果是实验结果的直接呈现，需要详细记录。
6. 图像记录，如果有条件，最好拍摄实验样本的荧光图像，并记录图像的拍摄条件和处理方法。
图像记录可以作为实验结果的直观呈现。
7. 结果分析，对实验结果进行简要分析和总结，包括样本的阳性率、荧光强度的定量分析等。
这些分析结果可以帮助理解实验结果的意义和可靠性。
以上是免疫荧光染色实验记录模板的基本内容，通过完整记录实验过程和结果，可以提高实验的可重复性和结果的可靠性，为科研工作提供有力支持。
免疫荧光实验报告
免疫荧光实验报告免疫荧光实验报告免疫荧光实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
本次实验旨在研究细胞膜上的蛋白质表达情况，并通过荧光显微镜观察和分析实验结果。
实验材料和方法本实验使用的材料包括细胞培养物、PBS缓冲液、甲醛、牛血清白蛋白（BSA）、荧光标记的抗体（一抗和二抗）、荧光显微镜等。
实验方法如下：1. 细胞培养：将细胞培养物均匀地分散在培养皿中，添加适量的培养基，并将其放入恒温培养箱中培养。
2. 固定细胞：在培养皿中加入PBS缓冲液，用甲醛进行固定处理，使细胞膜上的蛋白质保持原有的结构。
3. 蛋白质封闭：将BSA溶液滴加在固定后的细胞上，使其与细胞膜结合，防止非特异性结合。
4. 一抗处理：将荧光标记的一抗滴加在细胞上，使其与目标抗原结合。
一抗可以识别特定的蛋白质或抗原。
5. 二抗处理：将荧光标记的二抗滴加在细胞上，使其与一抗结合。
二抗通常与荧光染料结合，用于增强荧光信号。
6. 荧光显微镜观察：将处理后的细胞放置在荧光显微镜下观察，通过荧光显微镜的特定波长激发荧光标记的抗体，并观察荧光信号的分布和强度。
实验结果和分析在荧光显微镜下观察，我们可以清晰地看到细胞膜上的荧光信号。
这些信号代表了目标蛋白质的表达情况和分布。
通过对不同细胞或组织的荧光信号进行定量和比较分析，我们可以得出以下结论：1. 蛋白质的表达量：荧光信号的强度反映了蛋白质在细胞膜上的表达量。
强荧光信号表示高表达，而弱荧光信号则表示低表达。
通过与对照组进行比较，我们可以判断目标蛋白质的表达水平。
2. 蛋白质的分布：荧光信号的分布情况可以告诉我们蛋白质在细胞膜上的位置。
如果荧光信号集中在细胞膜的特定区域，说明该蛋白质在该区域有高表达。
而分散的荧光信号则表示蛋白质在整个细胞膜上均匀分布。
3. 蛋白质的定位：通过与其他标记物的共定位实验，我们可以确定蛋白质在细胞膜上的具体位置。
例如，我们可以使用荧光标记的抗体与细胞核染色剂共同处理，观察荧光信号与细胞核的重叠情况，从而确定蛋白质是否定位在细胞核。
大鼠核转录因子NF-kB酶联免疫分析
大鼠核转录因子(NF-kB )酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T80 ng/L -2000 ng/L使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中核转录因子(NF-kB )含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠核转录因子(NF-kB )水平。
用纯化的大鼠核转录因子(NF-kB )抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入核转录因子(NF-kB )，再与HRP标记的核转录因子(NF-kB )抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的核转录因子(NF-kB )呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠核转录因子(NF-kB )浓度。
试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
NF_KB的激活与检测方法
NF_KB的激活与检测方法生命活动中的一系列重要过程如细胞增殖、分化等是通过基因表达来实现的，这种基因表达控制首先通过特定转录因子在转录水平上进行。
核转录因子(nuclear transcription factor)是一类蛋白质，它们具有和某些基因上启动子(promotor)区的固定核苷酸序列结合，而启动基因转录的功能。
核转录因子kappa B(NF-κB)是其中重要的一组蛋白质，也是一类重要的转录激活因子，广泛存在于各种真核细胞中【1】。
1986年，Sen 等【2】首次从鼠B淋巴细胞核提取物中，发现一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子KB序列(GGGACTTTCC)特异结合，调节其基因表达的核蛋白因子，?称之为NF-κB。
它们可以调节许多与免疫功能和炎症有关的基因，在机体生理和病理条件下，发挥重要的功能。
现已表明NF-κB的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染等多种病理过程。
1. NF-KB的概述1.1 NF-KB/Rel蛋白家族及结构在哺乳动物细胞中共有五种NF-κB家族成员【3】，它们是原癌基因C—Rel、NF—κB1(p50／p105)、NF—κB2(p52／p100)、Re1A(p65)、RelB。
这些蛋白都有一个大约由300个氨基酸组成的氨基末端，称为Rel同源区(Rel homogeneous domain，RHD)或NRD(NF—κB／Rel／dorsa1)。
其RHD含DNA结合区，二聚体化区和核定位序列，分别具有与DNA -κB序列结合、与同源或异源亚基二聚体化以及与NF-κB抑制蛋白（IKB）家族成员相互作用并携带核定位信号（NLS），参与活化的NF-κB由细胞质向细胞核的迅速移动等功能。
根据结构、功能和合成方式的不同，Rel蛋白分为两类。
?一类为P50(?NF-?KB1）和P52(?NF-?KB2），?分别由含有C-末端锚蛋白重复序列（ahkrin ??repeat motif）的前体蛋白p105和p100通过ATP 依赖蛋白水解过程裂解而形成。
nf-kb入核免疫荧光检测实验记录
nf-kb入核免疫荧光检测实验记录NF-κB是一种转录因子，在细胞内起着重要的调控作用。
为了了解NF-κB的活性和定位，科学家们通常利用免疫荧光检测来进行实验。
下面是一份关于NF-κB入核免疫荧光检测实验的记录，其中不得出现链接。
实验目的：本实验旨在检测细胞中NF-κB的活性和定位，以了解其在细胞核内的转录调控作用。
实验材料和设备：1. 细胞系（例如人类胚胎肾细胞293细胞）。
2. 细胞培养基（例如DMEM）和胚胎牛血清（FBS）。
3. 4% paraformaldehyde（PFA）溶液。
4. PBS缓冲液。
5. 细胞裂解液（例如RIPA缓冲液）。
6. 3% BSA。
7. NF-κB抗体（例如兔抗人NF-κB抗体）。
8. Cy3（荧光标记的次抗体）。
9. 荧光显微镜。
实验步骤：1. 培养细胞系并将其接种到培养皿中。
保存细胞在37°C、5% CO2的环境中培养到合适的浓度。
2. 将培养皿中的培养基抽去，并用PBS缓冲液冲洗细胞3次，每次5分钟。
3. 用4% PFA溶液固定细胞，孵育15分钟。
4. 用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。
5. 用3% BSA溶液进行细胞膜的封闭处理，孵育1小时。
6. 使用适当稀释的NF-κB抗体溶液与细胞接触，孵育1小时。
7. 用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。
8. 使用Cy3标记的次抗体与细胞接触，孵育30分钟。
9. 用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。
10. 在显微镜下观察细胞，并使用合适的荧光标记通道检测Cy3的荧光信号。
实验结果：通过显微镜观察，我们观察到了细胞中NF-κB的荧光信号。
我们发现在核内存在明亮的红色荧光信号，表明NF-κB在核内特定结构中定位。
与此相比，胞质中的荧光信号相对较弱。
讨论：NF-κB作为一个转录因子，在细胞核内参与转录调控。
我们的实验结果表明，NF-κB在细胞核内存在集中的定位，并且与特定的细胞结构相互作用。
这一发现表明NF-κB可能通过与其他转录因子或调控元件结合来调控特定基因的转录。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
nf-kb入核免疫荧光检测实验记录
NF-κB (核因子-κB) 是一种重要的转录因子家族，参与调控免疫系统、炎症反应、细胞凋亡等生物学过程。
NF-κB的活性可以通过免疫荧光检测方法来研究，下面是一份关于nf-kb入核免疫荧光检测实验记录的参考内容。
一、实验目的：
本实验旨在研究细胞中NF-κB的入核情况，了解细胞对外界刺激的响应机制。
二、材料与方法：
1. 细胞培养：选取人类肺癌细胞株A549作为实验对象。
细胞培养于DMEM培养基中，含10%胎牛血清并添加1%青霉素/链霉素，37℃，5% CO2下培养至80%的接触抑制度。
2. 荧光抗体：购买荧光标记的NF-κB抗体（例如Alexa Fluor 488标记的NF-κB抗体）。
3. 实验组设置：
- 阴性对照组：未刺激的细胞作为阴性对照。
- 阳性对照组：使用某一强刺激剂（例如TNF-α）处理的细胞作为阳性对照。
- 实验组：将感兴趣的刺激剂处理在细胞上。
三、实验步骤：
1. 细胞处理：
- 细胞解离：使用1x trypsin-EDTA将细胞从培养瓶中溶解，制备单细胞悬浮液。
- 细胞计数：使用细胞计数板对细胞数目进行计数，并调整
至相同浓度。
- 细胞培养：将细胞分配至不同的培养皿中，每个培养皿
10^6个细胞，培养24小时，以附着于培养皿表面。
2. 干细胞因子处理：
- 阳性对照组：向培养皿中加入TNF-α，终浓度为10 ng/mL，处理细胞30分钟。
- 实验组：根据需要的刺激剂处理细胞样本，处理时间根据
文献中报道的最佳时间确定。
- 阴性对照组不添加任何刺激剂。
- 处理结束后将培养皿离心收集细胞。
3. 固定与渗透：
- 用PBS缓冲液洗涤细胞，并使用4% paraformaldehyde固定
细胞，室温孵育15分钟。
- 再次用PBS缓冲液洗涤细胞，重复三次
- 用1% Triton X-100渗透细胞膜，室温孵育10分钟。
4. 抗体染色：
- 去除 Triton X-100，用PBS洗涤细胞三次。
- 加入预先稀释好的荧光标记的NF-κB抗体，与细胞孵育2
小时。
- 洗涤细胞三次，去除多余的未结合抗体。
5. 荧光显微镜观察：
- 架设荧光显微镜，对细胞进行观察和记录。
- 观察不同组细胞中，NF-κB的入核情况。
- 根据需要，记录荧光信号的强度和定位。
四、结果与讨论：
1. 阳性对照组中，荧光信号强烈且明显定位在细胞核中，表明
NF-κB已入核。
2. 阴性对照组中，荧光信号较弱或不存在，表明未受外界刺激而无入核现象。
3. 实验组根据不同刺激剂的处理方式，分析荧光信号的强度和定位情况，进一步研究NF-κB的入核机制及其在细胞响应中
的作用。
以上为一份关于nf-kb入核免疫荧光检测实验记录的参考内容，实验设计和操作步骤可以根据具体研究的需求进行调整和优化。