体外培养细胞的生长与增殖过程
简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段
简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段体外培养细胞是指将细胞从其天然环境中取出，放入培养基中，在合适的条件下维持和增殖的细胞。
体外培养细胞的形态特征和生长阶段与细胞类型有关，但有一些共同的特征和阶段。
一般来说，体外培养细胞具有以下形态特征：1. 形态多样性：不同类型的细胞在体外培养中表现出不同的形态特征。
有的细胞呈悬浮生长，形成单个或成团的细胞群；有的细胞附着在培养器皿底部，形成单层或多层薄片。
2. 细胞大小和形状：体外培养细胞的大小和形状也变化多样。
有的细胞较小且呈圆形或椭圆形；有的细胞较大且呈扁平形或长条形。
3. 细胞分裂：体外培养细胞通常通过有丝分裂进行细胞增殖。
在分裂前，细胞会经历一段生长期，增加体积和细胞器数量，然后进入分裂期。
体外培养细胞的生长阶段包括以下几个阶段：1. 悬浮细胞的生长阶段：悬浮细胞通常分为四个生长阶段：lag期（适应期）、log期（指数期）、stationary期（平台期）和decline期（衰亡期）。
在lag 期，细胞正适应培养基的环境，准备开始增殖。
在log期，细胞开始快速增殖，细胞数呈指数增长。
在stationary期，细胞增殖速度减慢，细胞数趋于稳定。
在decline期，细胞死亡速度超过增殖速度，细胞数开始下降。
2. 附着细胞的生长阶段：附着细胞的生长阶段通常分为三个阶段：附着期、增殖期和平衡期。
在附着期，细胞接触到培养器皿表面，并开始附着。
在增殖期，细胞开始增殖并形成单层或多层细胞。
在平衡期，细胞增殖速度减慢，细胞数趋于稳定。
总结起来，体外培养细胞的形态特征和生长阶段是多样的，但都遵循一定的规律。
了解这些特征和阶段有助于科学家更好地控制和利用体外培养细胞，促进生物医学研究的发展。
体外培养细胞的生长与增殖过程-V1
体外培养细胞的生长与增殖过程-V1
体外培养细胞是生命科学研究领域中不可或缺的重要手段。
细胞在培
养基中的生长和增殖过程，被广泛用于疾病模型、药物筛选、基因工
程和组织工程方面的研究和应用。
以下是体外培养细胞的生长与增殖
过程的具体内容：
一、培养基的选择
1.基础培养基：常用的包括DMEM、RPMI1640、MEM等。
2.补充因子：用于维持细胞的生长和增殖，如FBS、B27、N2等。
3.抗生素：防止培养基被细菌、真菌等污染。
二、接种细胞
1.消化细胞：用酶或化学方法将细胞从组织或原代培养中分离出来。
2.计算细胞数目：使用细胞计数板或细胞计数仪。
3.培养皿：选择适合细胞生长的培养皿，如培养瓶、6孔板、96孔板等。
4.接种密度：根据细胞的不同特点和实验需求，选择适当的接种密度。
三、培养条件的控制
1.温度：常规为37℃。
2.气氛：常规为5% CO2/空气混合气氛。
3.液面：检查并调整液面，避免干涸和培养基变质。
4.培养时间：根据实验需求，适当调整培养时间。
四、细胞的观察与处理
1.细胞生长状态的观察：通过显微镜观察细胞形态、数量、分裂状态等。
2.细胞处理：进行细胞冻存、传代、取样等操作。
细胞在培养基中的生长与增殖是一个复杂的过程，需要仔细的控制和监测。
只有在做好基础工作、选择合适的培养条件和科学合理的实验设计之后，才能得到可靠的实验结果。
培养细胞的细胞生物学(体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生
培养细胞的细胞生物学（体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。
且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。
细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。
恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。
2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如 Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。
另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
第二章 动物组织培养
• 每 千 克 水中所含的毫渗透粒子数(mOsm/kg
H2O)（"毫渗摩尔每千克"）
精选课件
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5.营养物质
• 在 保 证 细胞渗透压的情况下，培养液里的成分
要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包
括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸
适中时又可以恢复上皮型特征。
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（三） 体外培养细胞的生长与增殖过程
精选课件
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三、动物细胞体外培养的特点
• 动物细胞生长缓慢，培养时间长。
• 更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支
原体）， 需要防治污染问题。
• 对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括
pH值、温度等。
• 对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡
萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。
• 原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。
细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细
胞及白血病细胞。
• 这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。
• 优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生
产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收
获细胞。
• 缺点 ： 不 如 贴附生长型观察方便，而且并非所
有的培养细胞都能悬浮生长。
•
贴壁细胞 经 悬浮适应后也可以长期悬浮培
总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养
难度更大。
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四、动物细胞体外培养的一般条件
1.环境无毒和无菌
2.适宜的温度 ： 人和哺乳动物培养细胞最适温度均
为35－37℃。
3.气体环境和氢离子浓度 ： 需要一定量的O2和CO2
动物细胞培养技术
育能力。 细胞呈现异质性 细胞的结构和功能最接近在体时情况
21
2. 主要生长生物学行为：
黏附和贴壁：是细胞培养能否成功的第一步 ① 细胞与固相表面亲和性的大小，主要与
细胞表面及固相表面所带电荷的性质和量有关 。
② 贴壁与黏附只是程度上的不同 ③ 不同细胞的黏附能力不同 ④ 影响细胞黏附和贴壁的因素： 培养液的温度、培养液中的离子成分及其 浓度、培养器皿表面包被的某些生物活性物质 22
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※ 低温的影响： （1）生理温度范围内，温度越低酶活性越低，当降到细胞 所能忍受的最低限度时，细胞的生命活动即受到抑制。 （2）使核分裂的时间延长 （3）使细胞的代谢活动降低 （4）能造成一定的细胞死亡
3.气相环境
※ O2（1995－9975pa）参与细胞的能量代谢过程，CO2（95
37
（4）IMDM （Iscove’s modified Dulbecco’s medium）属高糖型；适合于细 胞密度低，细胞生长较困难的情况。
（5）RPMI-1640（1630，1634） （6）HamF7、10、12 ：特点：添加了 微量元素和无机离子 (7) McCoy’s5A：适合于较难培养的原 代培养细胞
主要形态学特征：扁平，形态较为规整，呈 多角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧 密连接成单层细胞片，呈“铺路石状”。
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生长特点： 易相连成片 相靠—紧密相 连—成薄层—铺 石状 生长时呈膜状移 动 很少脱离细胞群 而单个活动
上皮型细胞
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（3）游走型细胞：
来源：具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞（
D.鼠尾胶原
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※合成培养基：基本培养基、无血清培养基
MRC-5体外培养细胞生长曲线测定 - 详细
MRC-5体外培养细胞生长曲线测定一．实验目的认识细胞接种和传代培养中细胞生长增殖规律。
二．实验原理在培养接种或每一次传代培养过程中，培养物都要经历相似的恢复和生长过程。
细胞生长曲线反映的是培养细胞从接种到传代之前的生长状况，也是判定细胞活力的重要指标。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，紧接着进入大量分裂的指数生长期。
在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平台期及退化衰亡4个部分。
以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制细胞的生长曲线坐标图。
三．实验准备3.1实验人员用品工作服、帽子、口罩、手套、肥皂、医用手臂消毒桶、0.1%新洁尔灭消毒液；3.2消毒和灭菌用品电炉、高压蒸汽灭菌锅、铝盒、24孔细胞培养板、移液管、枪头、洗耳球、离心管（规格：1.5mL/5mL/10mL）；3.3药品和试剂DMEM细胞培养液（10%血清）、0.25%胰蛋白酶-0.53Mm EDTA、PBS(-)；3.4 细胞MRC-5人二倍体细胞；3.5设备与器材CO2培养箱、离心机、移液枪（规格：1000uL、200uL）、二级生物安全柜、血细胞计数板、显微镜、记号笔、废液瓶；四．实验步骤4.1细胞接种4.1.1选择生长良好的MRC-5人二倍体细胞，移液管移除原细胞培养液至废液瓶中；4.1.2 DPBS润洗三次，每次5mL；4.1.3 吸管吸取1mL胰蛋白酶溶液浸润培养层细胞，37℃恒温消化2～10min；4.1.4用含10%血清的DMEM培养液4mL终止消化；4.1.5将终止消化后的细胞悬液用移液管转移至离心管中，1000r/min离心8min，弃上清；4.1.6吸管吸取2mL DMEM细胞培养液悬浮细胞；4.1.7对细胞悬浮液进行细胞计数；4.1.8调整悬浮液的细胞浓度分别为5×103个/mL(A) 、2×104个/mL(B)、 5×104个/mL(C)3种不同的细胞浓度（细胞理论数：1.575×104个）；4.2 细胞培养4.2.1依次将浓度为5×103个/mL(A) 、2×104个/mL(B)、 5×104个/mL(C)的细胞悬液分装于3个有盖的24孔细胞培养板，分别按每孔接种1mL，每种浓度各接21孔，进行细胞的悬浮培养；4.3 细胞换液细胞接种培养后，分别按照每间隔3d和5d换液一次。
体外培养细胞的生长与增殖过程(1)
体外培养细胞的生长与增殖过程(1)
一、细胞的生长与增殖过程
细胞生长和增殖是细胞学和生物学中的重要研究内容。
细胞生长指细
胞体积增大，细胞形态变化和代谢活动的增强，是细胞分裂的前提；
细胞增殖指细胞数目的增加，是细胞分裂的结果。
二、体外培养细胞的生长与增殖
体外培养细胞是指将体内原生质体外培养至固定形态的细胞，其能够
在无机溶液和特定的营养物质条件下，维持正常的生长和增殖过程。
在体外培养的细胞中，常常可以观察到以下过程：
1. 细胞贴附和生长：细胞在培养皿上吸附，贴附并向周围扩散，经过
一段时间的培养，细胞的生长速度逐渐增加。
2. 细胞周期：细胞生长的过程不是一直进行，而是依照细胞自身的周
期进行。
一个细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期。
其中，S期是DNA合成期，M期是有丝分裂期。
3. 细胞增殖：在适宜的培养条件下，细胞会不断地分裂，增殖数量逐
渐增多。
4. 细胞凋亡：当细胞在生长分化后达到一定阶段，其代谢均衡将失调，细胞停止生长且出现自我消亡迹象，即细胞凋亡。
三、体外培养细胞的应用价值
体外培养细胞技术是现代生命科学研究中非常重要的一部分。
它可以用于细胞生长、发育、增殖与凋亡的机制研究；提供大量、一致的细胞材料，可以用于生物工程、医学检测和药物筛选等。
同时，体外培养细胞还可以用于稳定细胞株的制备，对于生产生物制品、鉴定生物影响因素等方面也有重要的应用价值。
综上所述，体外培养细胞的生长与增殖过程是研究生物学和生命科学的重要方向，其应用价值在现代生命科学研究和工业生产中日益引人注目，具有广泛的应用前景和开发潜力。
细胞培养复习题(含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型:粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面, 而在悬浮状态下即可生长的细胞。
（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。
）⑵可分四型: (1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常, 体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段:①原代培养期: 也称初代培养, 是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。
此期的细胞呈现出活跃移动的特点, 可见细胞分裂, 但不旺盛。
处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。
细胞群具有明显的异质性, 细胞间的相互依存性强, 在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②. 传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期, 原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。
一般情况下, 正常体细胞在传代10-50次左右后, 细胞分裂的能力就会逐渐减弱, 甚至完全丧失, 细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞, 增殖速率已经变得很慢或不再增殖, 直至最后衰退死亡。
以上特点, 主要是针对体外培养的机体正常细胞, 对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言, 永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力, 这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态, 也称悬浮期。
此时细胞质回缩, 胞体呈圆球形。
时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上, 游离期结束。
底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动, 而无细胞分裂。
细胞株潜伏期一般为6～24小时。
④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长, 活力最佳, 最适合进行实验研究。
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4. 1.1 发展历史
4、近年： 淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了 一个新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大 量繁殖并产生单克隆抗体。 随着基因重组和单克隆抗体技术的发展，动物 细胞组织培养展现出越来越可观的工业化前景。
4.1.2 动物细胞的特点
（一）动物细胞之间的连接特点： 1.紧密连接：牢固、无间隙。 2.间隙连接： 2-3nm间隙。 3.隔壁连接： 20-30nm间隔，有横隔。 4.中间连接： 无横隔、透明，间隔20-30nm。 5.桥粒连接： 有间隙，有纤维形成的特殊结构。
动物细胞与组织培养：从动物体内取出 细胞或组织，模拟体内的生理环境条件， 在无菌、适宜温度和丰富营养条件下，使 离体细胞或组织生存、生长并维持结构和 功能的一门技术。 是动物细胞工程的重要技术基础。
4.1.4体外培养细胞的分型
贴附和非贴附生长： 1.贴附型细胞：细胞间相互接触；细胞与细胞外基 质（培养器皿壁或载体）结合。多数细胞属贴附型细 胞。 2.非贴附型细胞：此类细胞体外生长不必贴壁，可 在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤 细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。
第四章 动物细胞与组织培养
(Animal Cell and Tissue Culture)
动物体内取出组织和细胞，在体外模拟机体内的生理 条件，建立无菌、适温和一定的营养条件，使之生长 和生存，并维持其结构和功能的技术，称动物细胞与 组织培养。
是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、组织 工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、动物细胞 产品的大规模制备技术等等都离不开～。
贴附型细胞
4. 多形型细胞( polymorphic)： 形态上不规则（难以确定其形态）的细胞。 细胞胞体略呈多角形；细胞胞突细长形；类
似丝状伪足。 如神经元和神经胶质细胞
影响细胞形态的主要因素
细胞的来源不同； 生理条件不同，功能状态不同； 血清成分、培养基成分、 添加成分、培养基的酸碱 度、气象环境、温度等不同。
4.1.6 体外培养细胞的生长与增殖过程
4.1.6.1、细胞系的生长过程： 培养的细胞持续生长的时间有限，最终自行停止生 长。细胞的种类、性状、原供体的年龄决定其生存时 间长短。 如：人胚成纤维细胞存活一年、传30~50代相当于 150~300个细胞周期）；供体是成体或衰老个体时则 存活更短；肝、肾细胞仅能传几代或十几代。 获永生性或恶性转化（遗传性改变）生存期则发生 变化。
贴附型细胞(anchorage-dependent cell)
哺乳动物大多数细胞必须附着固体表面生长。当细胞布满表 面（单层）时，即停止生长。若取走一片细胞 ，存留的细胞就 会沿着表面生长而重新布满表面。从生长表面脱落而进入液体 的细胞通常不再生长而逐渐退化。（为单层附壁培养）
按培养细胞的形态，可分四类： 1.成纤维型细胞(fibroblast) 外形与体内成纤维细胞相似，梭形或不规则形。 细胞贴壁后呈梭形，胞质外伸出2-3个长短不同的突起，成 放射状，胞间疏松。 起源于中胚层的细胞在体培养时一般表现为这种形式。
4.1.2 动物细胞的特点
（二）动物细胞的培养特点： 1.动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。 2.动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。 3.培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。 4.动物细胞间主要以聚集体形式存在。 5.原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
4.1.3 动物细胞与组织培养的概念
4.1.5 体外培养细胞的生长特性
1、 贴附： 细胞接种后很快形成伪足，与底物点接触，细
胞逐渐呈放射状伸展，细胞体中心变扁平状。 影响因素：低钙不利于细胞伸展；低温和培养
液流动过快妨碍贴附；生物因素：表皮生长因子 （刺激神经胶质细胞的皱褶活动）、成纤维细胞生 长因子（减少3T3细胞的扁平度）。
4.1.5 体外培养细胞的生长特性
贴附型细胞
2. 上皮型细胞(epithelium)： 泛指形状上类似上皮细胞的细胞。特点：扁平状，
形态较为规则。胞间紧密，单层贴壁。起源于内、外 胚层的细胞体外培养时如此。 3. 游走型细胞(wandering)：
类似巨噬细胞样的特征。外形不规则。 分散生长，不连接成片，成群落；通常伸出伪足和 突起，贴壁位置不固定，呈活跃的游走和变形运动。 单核巨噬细胞系细胞体外培养常如此：颗粒性白细 胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。
4.1 概 述
4. 1.1 发展历史 4.1.2 动物细胞的特点 4.1.3 动物细胞与组织培养的概念 4.1.4 动物细胞的体外培养生长特性
4. 1.1 发展历史
1、动物细胞（组织）培养技术的起源： 19世纪所应用的胚胎学技术。 动物细胞培养的奠基人：美国生物学家哈里森
（1907年）用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将 蛙胚神经组织培养在淋巴液中，存活几周，有细 胞突起的生长过程。
2、接触抑制（contact inhibition）： 正常细胞移动、靠近而接触时，细胞不再移动且
停止接触区质膜的皱褶活动和细胞运动以及细胞的 重叠生长。肿瘤（癌）细胞无此现象。 3、密度抑制（density inhibition）：
只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。 但细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多 时，（因营养和代谢物的影响）细胞分裂停止，出 现接触抑制。
如HeLa细胞原本是一种上皮型癌细胞，但若在过酸 或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱适中时 又可以恢复上皮型特征。
非贴附型细胞或悬浮型细胞（suspend cell）
此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中 悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤细胞 和杂交瘤细胞以及转化细胞系等。
形态：始终为球状 优点：细胞密度高，培养效率高，易操作控 制，便于大规模生长。 有些细胞既可悬浮，也可以贴附。
先驱者中法国学者卡勒尔：设计卡氏培养瓶自 1923年用于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使 多种动物组织培养获得成功。
4. 1.1 发展历史
2、20世纪40年代以后： 动物组织培养的科学家们研究重点集中在培养
基方面。 3、20世纪80年代以后：
随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发 展，已能把特定的外源基因通过PCR技术扩增几 千倍，并可转染到细胞内，使其得到高质量的表 达。