实验 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及
实验三血红蛋白吸收及其衍生物光谱分析
重复测量
为确保数据的可靠性，对每个样品进行多次 测量，并对结果取平均值。
数据处理与分析
数据整理
01
将测量得到的光谱数据整理成表格形式，便于后续分
析。
光谱拟合
02 采用适当的数学方法对光谱数据进行拟合，提取出各
物质的特征吸收峰及其对应的吸光度值。
数据分析
03
根据拟合结果，分析各物质在光谱上的差异，并结合
已知的化学结构信息，推测可能的相互作用机制。
04 结果与讨论
血红蛋白及其衍生物的光谱数据
血红蛋白光谱数据
在可见光范围内，血红蛋白表现出几个明显的吸收峰，这些峰对应于不同电子跃迁的吸 收。
血红蛋白衍生物光谱数据
在血红蛋白光谱的基础上，通过化学修饰或生物合成得到的衍生物也表现出类似的光谱 特征。
光谱数据的分析
光谱分析的应用
光谱分析在化学、生物学、医学等领域有广泛的应用 。
血红蛋白光谱吸收的机制
血红蛋白光谱吸收的定义
血红蛋白光谱吸收是指血红蛋白分子对特定波 长的光吸收能力。
血红蛋白光谱吸收的机制
血红蛋白分子中的亚铁血红素基团光谱吸收的应用
血红蛋白光谱吸收可用于研究血红蛋白的结构和功能，以及诊断和治疗相关疾 病。
衍生物的光谱变化
当血红蛋白与某些物质结合形成衍生物时， 其光谱特性发生明显变化。特别是在某些波 长范围内，吸收强度显著增加或减少，这表 明血红蛋白与这些物质的相互作用影响了其 光谱特性。
本实验的局限性
样本来源限制
实验使用的血红蛋白样本来源于实验室，而非实际生物体内的血红蛋白。因此，实验结果可能与实际生理环境中 的情况存在差异。
峰位分析
通过对光谱数据的峰位进行分析，可以确定血红蛋白及其衍生物的电子跃迁类型和能级结构。
分析化学实验报告范文9血红蛋白脱辅基和重组-2022-1210
分析化学实验报告范文9血红蛋白脱辅基和重组-2022-1210血红蛋白(Hemoglobin)脱辅基和和重组一、实验目的1.通过实验，了解结合蛋白的变性与变性条件下的行为，从而对结合蛋白中辅基的作用有更深的认识。
2.学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质脱辅基和重组的方法。
3.掌握柱层析法。
二、实验原理血红蛋白是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000Da。
四个亚基中的两个亚基的氨基酸序列相同，称为α–亚基，每条链含141个氨基酸。
另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β–亚基，各含146个氨基酸。
α与β亚基有各自的二级、三级空间结构，亚基间以非共价键结合在一起。
每个亚基中均含有一个血红素辅基，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。
Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe(Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白（MHb），其失去可逆载氧的功能。
血红素与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括:①Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8Hi)上的Nε上的配位键；②卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白质氨基酸侧链之间的盐桥；③卟啉环中乙烯基与蛋白质的疏水相的相互作用。
在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。
利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。
分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以再用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。
由于高铁血红蛋白（MHb）的紫外可见吸收光谱中，在405nm处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白(ApoHb)只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白（MHb）又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。
《血红蛋白含量测定》实验综述报告
《血红蛋白含量测定》实验综述报告血红蛋白是由珠蛋白、亚铁血红素等组成，作为红细胞内的一种机能蛋白，在生物体内起到传输氧气、传递电子等功能，与氧和能量代谢有关的重要活动。
在临床上出现各类贫血、白血病及心脏病等症状常与血红蛋白异常有关，因此，人体血液中和尿液的血红蛋白含量的测定是临床检测的一个重要内容。
通常用血红蛋白内的珠蛋白和亚铁血红素在血液中的总浓度来表示。
血红蛋白成分的评价应用范围较广，其涉及动物学、医学、体育学、生物工程学等领域。
目前，随着检验技术的飞速发展和医疗器械的不断改进，目前，血红蛋白含量检测方法主要有比重法、比色法721分光光度仪法、光电比色、电流阻抗法、胶体金法溶血测试条等6个不同方法测定。
1 比重法比重法是血红蛋白测定的最原始的方法，在血库或大量的献血员采血时为了节约时间，看是否贫血，在硫酸铜溶液中加入一滴于溶液中，通过其浮力方法是否大于排开水的重量如果沉入杯底，可以献血，血滴漂浮为贫血。
通过血滴在水中的比重变化来观察人体是否贫血，此方法是基于对血滴重量和在水中浮力进行测量，通过肉眼观察，粗略估计而得出的。
是依据阿基米德原理，血红蛋白是由各种亚铁血红素等构成的，血红蛋白内珠蛋白和亚铁血红素的量多少，直接影响血红蛋白含量多少，因此通过血红蛋白比重法可推算出是否贫血。
该方法不需要特定的设备，操作简单，但准确度低，没有准确的文字描述，不适合推广。
只用于一般体检且对受试者体能状况有一定的要求，故对体质较弱的人群不要采用。
2 血红蛋白目测比色法血红蛋白目测比色法是对比重法的替代，此测定器材包括两个部分，一个是比色管，一个是参照比色槽。
取0.1mol/L稀盐酸溶液2-3滴加于比色管中，再加20ul血液于比色管中，混匀、静置15分钟，不断加蒸馏水于亮光处与比色槽颜色相对照一样，液体的高度即可读取刻度即血红蛋白含量。
由于指定颜色与刻度存在对应关系，进而可以推算出受试者的血红蛋白浓度。
比色法的优点是受试者可以准确知道血红蛋白含量。
实验一、血红蛋白吸收光谱的测定
实验一、血红蛋白吸收光谱的测定一、溶血液的制备擒拿固定小白鼠，用手术镊摘除其一只眼球，取眼底血2滴于10ml蒸馏水（D.W）中，混匀。
二、吸光度测定与A-λ曲线的绘制取两只比色皿，分别装入蒸馏水、溶血液，在波长（λ）520nm~600nm的范围内，每次均以D.W调零，用分光光度计测溶血液吸光度A值，再在坐标纸上绘制A-λ曲线，并找出λmax值。
λ520 525 530 535 537 539 541 543 Aλ545 550 555 560 565 568 570 572 Aλ574 576 578 580 585 590 595 600 A▲注意事项：1.λ的选择原则：远离吸收峰时，间隔5nm；靠近吸收峰时，间隔2nm。
2.溶血液的A值在0.2~0. 8之间与溶血液的浓度线性较好。
3.氧合血红蛋白在波长为541nm、577nm、404nm、280nm及210nm处有峰值；还原血红蛋白在波长555nm处有峰值。
本次实验对象为氧合血红蛋白。
4.在A-λ曲线中描出λmax1、λmax2，并写出具体波长值。
三、结果及结果分析实验二、蛋白质性质实验一、等电点（pI）测定当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，所带静电荷为零，则溶液pH值称为蛋白质的等电点，此时蛋白质易从溶液中析出。
1.操作及结果1号管（pH=5.9）2号管（pH=5.3）3号管（pH=4.7）4号管（pH=4.1）5号管（pH=3.5）0.01mol/L醋酸0.3 — — — —0.1mol/L醋酸— 0.15 0.5 2.0 —1mol/L醋酸— — — — 0.8D.W（ml） 4.2 4.35 4.0 2.5 3.7混匀，各加入0.5ml酪蛋白液，混匀，静置，观察浑浊度。
10min后的浑浊度30min后的浑浊度pH≈pI时，试管中底部沉淀最多，上端较清亮。
2.结论二、茚三酮反应蛋白质的基本结构单位是氨基酸，水解后产生氨基酸。
血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定
血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定一、实验目的：1、了解722s型分光光度计的结构原理，并掌握其使用方法。
2、掌握血红蛋白及其衍生物的吸收光谱曲线的绘制。
3、了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定。
二、实验原理：1、可见-紫外分光光度法：利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性、定量及结构分析的方法。
单色光通过吸光溶液后，吸光度与溶液的浓度和厚度之间呈正比关系。
即符合光吸收的基本定律：Lanbert－Beer定律2、血红蛋白（Hb）及其衍生物具有特征性的吸收光谱，可作为它们定性和定量分析的基础。
如氧合血红蛋白（HbO2），在可见光波长400～700nm范围内有三个特征性的吸收峰，分别称为γ、α及β吸收带，其峰值或最大吸收波长（λmax）分别在415、541和576nm处。
γ带是由原卟啉的电子云所引起，α及β带则决定于铁原子电荷及其配体性质。
在正常人的动脉血中，Hb大部分以HbO2形式存在。
当向HbO2溶液中通入CO时，因Hb与CO的结合力比氧大得多，故可迅速转变为碳氧血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，峰值蓝移（向短波方向移动），并在波长419、540和569nm处出现三个特征性的吸收峰。
3、本实验先制备Hb及其衍生物，然后在不同波长下测其吸光度A（又称光密度），以A 为纵坐标，波长为横坐标绘制吸收光谱曲线，由此可以确定它们最大的吸收波长。
对定量而言，在峰值波长下进行测定，其灵敏度较大。
三、实验步骤：1.样品的制备①氧合血红蛋白（HbO2）液：取贮存血红蛋白液0.lmL（2滴）盛于小烧杯中，用量筒加20mL蒸馏水，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。
②碳氧血红蛋白（HbCO）液：取上述HbO2液约5mL至大试管中，通入CO约30s～1min，，当鲜红色变为樱桃红色时停止通气，HbO2即变成HbCO。
2.吸收光谱曲线的绘制①将上述制备的2种血红蛋白溶液分别盛于比色杯内，在722s型分光光度计上以蒸馏水作为溶剂空白调节吸光度零点。
红细胞计数血红蛋白测定的原理
2.还原血红蛋白（reduced hemoglobin, Hbred）：未 与O2结合时的Hb。
3.高铁血红蛋白（hemiglo -bin, Hi）或正铁血红蛋白 （methemoglobin, Mhb）: Fe 2+被氧化成Fe 3+。
▪ 1%Hb的铁呈Fe3+状态，称为高铁血红蛋白 （Hi）。
Hb的合成受激素的调节：Epo和雄激素。
▪ 注意事项：1. 如α-链或β-链合成障碍，使三种正常 血红蛋白比例异常，即各型地中海贫血；如多肽 链发生氨基酸置换、丢失、加长，称为血红蛋白 病。
2.病理情况下可出现硫化血红蛋白（SHb）。
（二）血红蛋白衍生物及其吸收光谱
测定方法
显微镜计数法 血液分析仪法
（一）显微镜计数法
【检测原理】 采用等渗稀释液将血标本稀释一定倍数，滴入血 细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞 数，经换算得每升血液中红细胞数量。
【器材】 微量吸管，采血针，小试管，计数板，盖片，棉球， 显微镜。 【试剂】红细胞稀释液：任选一种 1.Hayem稀释液：氯化钠1.0g、硫酸钠（含10个结晶 水）5.0g，氯化高汞0.5g，蒸馏水加至200mL，过 滤后使用。 氯化钠---调节渗透浓度 硫酸钠---提高比重防止红细胞粘连 氯化高汞---防腐剂，有毒
5个中方格内红细胞数
或= 100
×1012/L
【报告方式】
RBC（/L）= .
× 1012/L
【方法学评价】 1．手工显微镜法 2．血液分析仪法
为目前主要临床检验细胞计数方法 变异系数（coefficient of variation, CV ）小。
分析化学实验报告9. 血红蛋白脱辅基和重组-2013-1210
血红蛋白(Hemoglobin)脱辅基和和重组一、实验目的1.通过实验，了解结合蛋白的变性与变性条件下的行为，从而对结合蛋白中辅基的作用有更深的认识。
2.学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质脱辅基和重组的方法。
3.掌握柱层析法。
二、实验原理血红蛋白是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000Da。
四个亚基中的两个亚基的氨基酸序列相同，称为α–亚基，每条链含141个氨基酸。
另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β–亚基，各含146个氨基酸。
α与β亚基有各自的二级、三级空间结构，亚基间以非共价键结合在一起。
每个亚基中均含有一个血红素辅基，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。
Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe (Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白（MHb），其失去可逆载氧的功能。
血红素与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括:①Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上的Nε上的配位键；②卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白质氨基酸侧链之间的盐桥；③卟啉环中乙烯基与蛋白质的疏水相的相互作用。
在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。
利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。
分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以再用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。
由于高铁血红蛋白（MHb）的紫外可见吸收光谱中，在405nm 处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白(ApoHb)只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白（MHb）又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告一、实验目的本实验的目的是通过凝胶层析分离法，将血红蛋白与核黄素进行分离，并通过紫外吸收光谱法进行检测。
二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小差异的分离方法，其原理是将待分离物质通过一定孔径大小的凝胶柱，使大分子无法进入孔隙而被留在柱上，小分子则能够穿过孔隙而流出柱底。
血红蛋白和核黄素在凝胶层析柱中的迁移速率不同，因此可以进行有效分离。
三、实验材料与仪器1. 血红蛋白和核黄素样品；2. Sephadex G-25凝胶柱；3. 紫外吸收光谱仪；4. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。
四、实验步骤1. 将Sephadex G-25凝胶柱用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤至平衡状态；2. 将样品混合后加入到凝胶柱中，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）作为流动相；3. 收集柱底流出的分离物质，用紫外吸收光谱仪进行检测。
五、实验结果与分析1. 实验结果将血红蛋白和核黄素样品通过凝胶层析柱进行分离后，收集到了两种物质。
经过紫外吸收光谱检测，血红蛋白的最大吸收波长为280nm，核黄素的最大吸收波长为375nm。
2. 结果分析通过凝胶层析法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离。
在紫外吸收光谱检测中，血红蛋白和核黄素都有明显的吸收峰。
由于两种物质在不同波长下具有不同的最大吸收值，因此可以通过紫外吸收光谱法对其进行定量检测。
六、实验注意事项1. 凝胶柱洗涤至平衡状态后再加入样品；2. 流动相需保持恒定；3. 采用紫外吸收光谱法时需注意波长选择。
七、实验结论本实验通过凝胶层析分离法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离，并通过紫外吸收光谱法进行了检测。
该方法简单易行，可用于生物大分子的分离和检测。
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3.吸收光谱曲线的绘制
以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描 点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白 及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器 不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸 收光谱必有一些差异，对722型分光光度计 来说，峰值误差在±3nm~5nm波长内是允 许的。
注意事项
分光光度计应放在干燥处，使用温度为5~35℃。远 离强电场、磁场
为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命
每次做完实验时，应立即洗净比色皿 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记
思考题
• 1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍 生物的吸收光谱有何意义？ • 2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特 征反映它的什么结构成分？
目的要求
掌握722型分光光度计的使用 了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定 掌握血红蛋白标准曲线的绘制
实验原理
分光光度计的使用 溶液中的物质在光的照射激发下，产 生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是 具有选择性的，各种不同的物质都具有其 各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶 液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量 减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关 系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律
内有3个特征的吸收峰，其峰值分别在415、 541和576nm处，当氧合血红蛋白转为碳氧 血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变， 在波长419、540和569nm处出现三个特征 的吸收峰，其中在500~600nm范围内2个 特征的吸收峰如下图。
项目 HbO2 HbCO
吸收峰数 2 2
吸收光谱（nm） 541 577 540 569
用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动， 即制得全血。
（1）氧合血红蛋白（HbO2）液：
加蒸馏水20ml， 取全血0.1ml（3滴）盛于 小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。 （2）碳氧血红蛋白（HbCO) 液： 取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体 （浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10 秒钟，HbO2即变成樱桃红色
血红蛋白(Hb)与O2结合生成氧合血红蛋白 (HbO2)，与CO结合生成碳氧血红蛋白(HbCO)。 因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透
过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显
出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定
性和定量分析的基础。
如HbO2在可见光波长400~600nm范围
仪器和试剂
1．仪器：试管；吸量管； 量筒；722型分 光光度计；CO发生器。 2．试剂： （1）浓H2SO4；
（2）甲酸； （3）蒸馏水； （4）血红蛋白溶液。
（5）NaOH；
实验操作
预热仪器 选定波长
分光光度计的使用
调节“0”点 调节T=100％ 测定
关机
1．样品的制备：
2．吸光度测定：
（1）将如上制备的2种血红蛋白液分别 盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸 馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一 次读数均应用空白管调节零点和100%）。
（2） 先从波长500~600nm分别测定 HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰 值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度 读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读 数）。
朗伯比尔定律： A=εlc
A：物质的吸光度
ε：摩尔吸光系数 l：液层的厚度 c：溶液的浓度
比色皿的使用
• 手持毛玻璃面，不可触碰光滑面
• 使用前要再用少量（大约1-2ml）待测溶液 润洗1次 • 使用时比色皿光滑面对准光路 • 使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清 洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用 蒸馏水润洗1-2次）