实验七血红蛋白
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
血红蛋白的检测
一血红蛋白的提取和分离实验的方法：1：实验材料，仪器，试剂及试剂的配制（1）实验材料：新鲜的鸡血（2）实验仪器：离心机，烧杯（100ml），胶头滴管，玻璃棒，离心管架，漏斗，纱布等。
（3）实验试剂：饱和（NH4）2SO4溶液（PH=6.0~7.0），柠檬酸钠溶液，生理盐水，蒸馏水。
（4）试剂的配制：1. 饱和（NH4）2SO4溶液的配制：100ml蒸馏水中溶解76g（NH4）2SO4，用氨水滴PH值至6.5左右；2.生理盐水的配制：取9gNaCl溶于1000ml蒸馏水中。
3.柠檬酸钠溶液的配制：6g柠檬酸钠溶于100ml生理盐水中（可收集100ml鸡血）。
2：实验步骤：（1）收集并清洗鸡血：用盛有柠檬酸钠溶液的烧杯装新鲜的鸡血（防止鸡血凝固），然后将鸡血用300ml生理盐水稀释，充分搅拌后转移到50ml离心管中，离心（V=5000rpm）5min（此步可除去血清蛋白）。
（2）破碎鸡血细胞：小心倒掉上清，下层细胞加入50ml的蒸馏水，剧烈震荡10min，离心（V=5000rpm）10min.。
取上清溶液，即血红蛋白的溶液，用多层纱布过滤。
（3）盐析分离血红蛋白：向滤液中逐渐加入（NH4）2SO4饱和溶液，边加边摇，约加入与血红蛋白溶液相同体积时，溶液出现浑浊。
静止20min，离心10min(v=5000rpm).。
红色沉淀就是分离出来的血红蛋白。
血红蛋白溶液通过盐析并离心后得到红色沉淀，此时上清溶液基本无色，表明该沉淀就是我们分离得到的血红蛋白，无需用其他方式进行验证。
下面就几点进行讨论;1我们购买鸡血时，为了防止鸡血凝固，把鸡血收集到事先准备好的盛有柠檬酸钠溶液的瓶子里，可以放置一白天，若要过夜，温度须控制在4摄氏度。
2我们用蒸馏水使细胞涨破而不用甲苯（有毒），既简单又安全，同时还可以将血红蛋白溶液进行稀释。
3用盐析法进行蛋白质分离试验，比通过色谱柱，减少了实验难度，降低了试验成本，缩短的试验时间。
血红蛋白异常所致的贫血及其实验诊断考点总结
血红蛋白异常所致的贫血及其实验诊断考点总结<大纲要点>一、血红蛋白的结构与功能二、血红蛋白异常的检验及其应用三、血红蛋白病的实验诊断一、血红蛋白的结构与功能（1）血红素血红素是Hb、肌红蛋白、多种酶（如过氧化氢酶）和多种细胞色素的辅基，其合成的场所主要在骨髓内的幼红细胞和肝细胞线粒体。
与临床有关的是尿卟啉、粪卟啉和原卟啉，当卟啉代谢障碍时，血红素合成不全，并可能产生卟啉病。
（2）珠蛋白人类的珠蛋白肽链有α、β、γ、δ、ε、ζ链；这些肽链按四级结构形成Hb。
（3）生理性血红蛋白几种正常生理性血红蛋白在胎儿时期和出生后有明显的不同。
新生儿期内HbF （α2γ2）仍高，以后2～4个月渐下降，1岁左右接近成人水平。
成人血红蛋白HbA（α2β2）出生后逐渐增多，占95%～97%，HbA2（α2δ2）出生后占1.2%～3.5%。
（熟练掌握）血红蛋白结构及功能示意图正常生理性珠蛋白链的合成二、血红蛋白异常的检验及其应用1.血红蛋白电泳（原理了解，其余掌握）2.抗碱血红蛋白测定（熟练掌握）3.异丙醇沉淀试验（掌握）4.红细胞包涵体试验（掌握）5.HbA2测定（熟练掌握）6.珠蛋白肽链分析（掌握）7.红细胞镰变试验（掌握）1.血红蛋白电泳原理：根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动，反之，Hb带正电荷向阴极泳动。
经一定电压和时间的电泳，不同的血红蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。
参考值：pH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳，正常血红蛋白电泳区带：HbA＞95%、HbF＜2%、HbA2为1.0%～3.1%。
pH8.6TEB缓冲液适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与HbBarts不能分开和显示，应再选择其他缓冲液进行电泳分离。
血红蛋白电泳实验报告
实验汇报实验名称：血红蛋白电泳项目名称：两种碱性血红蛋白样品处理方法的电泳结果实验时间：2018年9月17日实验室：龙泉驿区妇幼保健院检验科实验人员：杨松报告单位：成都温伦科技有限公司一、实验目的：1、掌握生理盐水处理血红蛋白样品的方法2、掌握四氯化碳处理血红蛋白样品的方法3、掌握电泳仪实验的操作4、分析两种碱性血红蛋白样品处理方法电泳结果的不同二、实验原理：血红蛋白电泳就是利用在电场的作用下, 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小, 形状等性质的差异, 使带电分子产生不同的迁移速度, 从而对样品进行分离, 鉴定或提纯的技术，在临床检验中, 主要用于分离各类蛋白分子。
三、实验方法：琼脂糖电泳法四、实验器械：样品：10个EDTA抗凝管抽取的病人全血样品试剂：0.9%生理盐水500ml，四氯化碳500ml，界面液250ml，美国Helena Spife3000血红蛋白电泳检测试剂盒器材：移液枪，一次性移液枪头若干，EDTA抗凝管10个，玻璃试管10个设备：美国Helena Spife3000 全自动电泳仪五、实验步骤：1、取得医院检验科EDTA抗凝管抽取的病人全血样品10个，编号为1，2,3......10。
2、将1-10号十个个样品分别用移液枪取200ul到玻璃试管中，编号为1-1,2-1,3-1,.....10-1。
3、将1-10号10个样品进行生理盐水前处理，处理方法如下：-用0.9%生理盐水混匀，3500 rpm离心10分钟.-吸走弃去清液。
-以上步骤连续进行三次。
-完全吸走弃去上清液。
-20ul制作后的样本+80ul溶血素，混匀。
-取溶血后的样本17ul加入样品孔。
4、将1-1到10-1号10个样品进行四氯化碳前处理，处理方法如下：-用0.9%生理盐水溶液5000μL与样品混合。
-3000rpm离心5分钟。
-弃去上清液，只留下红细胞。
-加入200ul 蒸馏水溶解红细胞。
-加入300ul 的四氯化碳，混合均匀，3000rpm离心5分钟。
血红蛋白测定实验
血红蛋白测定实验一、实验目的与任务了解XF—1B型（或Hb—2000型）血红蛋白仪的使用方法，掌握血红蛋白的测定技术。
有训练运动员在较好训练效果的影响下血红蛋白正常值高于正常成年人，因此，血红蛋白的测定是评定训练效果的重要指标。
二、原理测定血红蛋白的方法很多，常见的有直接比色，光电比色法，沙利氏比色法（间接比色法）。
我们现在实验室用的是XF—1B型和Hb—2000型血红蛋白仪。
此仪器是采用氰化高铁法，应用光电比色的原理测定血红蛋白值的，其原理是：将全血样品20ul注入5ml氰化高铁血红蛋白稀释液内（亦称文—齐氏液），作251倍稀释，溶化红细胞释出血红蛋白。
稀释剂将血红蛋白先转变成高铁血红蛋白，再转化为氰化高铁血红蛋白。
然后，再用XF—1B 型（或Hb—2000型）Hb仪比色法直接测定显示浓度数，不需任何换算（每次测定只需5秒钟）。
三、实验器材XF—1B型和Hb—2000型血红蛋白仪、一次性血细胞吸管（刻度10～20ul）、采血针、75%酒精、消毒棉球、培养皿、烧杯、可调加液器、试管架、血红蛋白测定试剂（文—齐氏液）、氰化高铁血红蛋白标准液。
四、实验步骤1、插上电源，打开血红蛋白仪电源开关，按动进样开关，重复三次吸入蒸馏水，并通电预热20～30分钟。
观察显示是否为“零”。
（按出Hb仪器左下角“测试—定标”按键，使之处于“测试”状态。
）2、取试管一支，加入Hb测定试剂（文—齐氏液）5ml，放在试管架上备用。
3、采血、比色：先消毒，再用采血针在耳垂或无名指尖处采血，用干棉球擦去第一滴血，待第二滴血自然流出一大滴时，用血细胞吸管取血液20ul（注意：吸管内不可有气泡，否则需重新采血）。
擦去吸管外血液后，轻轻吹入测定管底部，并回吸数次洗净吸管，然后充分混合均匀。
待5分钟后，置Hb仪上比色。
4、记录：直接读数，记录下来。
Hb值通常以每100 ml血液中含Hb若干克来表示。
（g/ml）。
本仪器采用国际单位制（g/L），可直接显示Hb值（g/L）。
血红蛋白病实验室检查
血红蛋白病实验室检查
……
我国北京、上海等大城市已建立先进的基因诊断技术，对多种遗传血液病如血友病，α海洋性贫血、β-海洋性贫血、异常血红蛋白病等成功地进行了基因诊断和产前基因诊断：
1．常用基因诊断方法为抽提全血、干纸片血、羊水细胞、绒毛细胞DNA作DNA点杂交，适用于诊断基因缺失的遗传病，如α海洋性贫血病人α珠蛋白基因不同程度的缺失。
2．限制性内切酶酶谱法，适用于诊断基因突变改变了限制酶切点或DNA缺失而改变酶解片段大小长短的遗传病。
3．限制性片段多态性分析（RFLP），RFLP按孟德尔方式遗传，如某种遗传病基因与特异的RFLP紧密相连，即可将这一多态片段作为"遗传标记"，通过RFLP连锁分析推测该家庭成员和胎儿是否携带遗传病基因，RFLP连锁分析适用于诊断任何一种单基因遗传病。
4．寡核苷酸杂交是一种直接基因诊断技术，对于基因突变部位的碱基序列已查明的遗传病，均可以直接检测和鉴定其突变的基因。
5．聚合酶链反应（PCR）DNA体外扩增，此种高效DNA分析技术可以直接通过PCR产物的电泳分析进行基因诊断，适用于诊断基因缺失或部分DNA缺失所致的遗传病。
6．对非缺失型突变基因可结合限制酶切位点的改变，如与RFLP 位点相连锁，则可用限制酶消化PCR扩增产物，直接电泳分析，不需应用基因探针进行分子杂交，大大简化实验操作，使基因诊断可在半天内完成。
血红蛋白测定
血红蛋白测定
一、氰化高铁血红பைடு நூலகம்白测定法
【目的】 掌握氰化高铁血红蛋白 (HiCN) 测定方 法的原理及操作。 【原理】 在HiCN转化液中，红细胞被溶血剂破坏， 各种血红蛋白（SHb除外）中的Fe2+被高铁氰化钾 氧化成Fe3+，形成高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰 化钾提供的氰根离子（CN-）结合生成稳定的复合 物氰化高铁血红蛋白(HiCN )。棕红色的HiCN在波 长540nm处有吸收峰，用分光光度计测定该处的吸 光度，再换算成每升血液中的血红蛋白浓度，或 用HiCN参考液进行比色法测定制作标准曲线供查 阅。
二、十二烷基硫酸钠血红蛋白测定法
【目的】 了解十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-Hb） 测定法的原理及操作。 【原理】 十二烷基硫酸钠为一种阴离子表面活性 剂，具有轻度氧化作用；血液中除SHb以外的所有 血红蛋白均可与低浓度的SDS作用，亚铁血红素被 氧化成稳定的棕红色高铁血红素样复合物（SDSHb）。由于SDS-Hb的毫摩尔消光系数尚未确认， 故不能根据标本吸光度直接计算结果；需用HiCN 法及本法分别测定多份不同浓度抗凝血或溶血的 血红蛋白浓度和吸光度，以此绘制标准曲线，间 接计算血红蛋白浓度。
【操作】 1．加转化液 2．采血与转化 3．测定吸光度 4．计算 5．报告方式：XX g／L
【注意事项】 1．分光光度计校正。 2．HiCN转化液应以蒸馏水配制（不能用去 离子水），pH稳定在7.0～7.4；HiCN转化 液中氰化钾是剧毒品，配制转化液时要按 剧毒品管理程序操作；HbCO转化为HiCN的 速度缓慢，可适当延长转化时间或加大试 剂中K3Fe(CN)6的用量。
【操作】 1．制备标准曲线 2．测定 【注意事项】SDS液可破坏白细胞，因此对 某些血液分析仪不宜使用。
红细胞定性实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 观察红细胞的基本形态和结构。
2. 了解红细胞在血液中的功能。
3. 掌握使用显微镜观察红细胞的基本方法。
二、实验原理红细胞是血液中数量最多的血细胞，其主要功能是运输氧气和二氧化碳。
红细胞含有血红蛋白，这是一种含铁的蛋白质，能够在氧含量高的环境中与氧结合，在氧含量低的环境中释放氧。
通过显微镜观察红细胞，可以了解其形态、大小、颜色等特征。
三、实验材料与器材1. 实验材料：外周血或抗凝血（EDTA抗凝）。
2. 实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、微量吸管、改良Neubauer计数板、RBC 稀释液、生理盐水、75%乙醇、消毒棉签、载玻片、盖玻片。
四、实验步骤1. 制备血涂片- 取一小试管，加入2.0 ml RBC稀释液。
- 采血10μl，用消毒棉签擦去管外血液，轻轻吹入试管底部。
- 清洗吸管2~3次，立即混匀。
- 将混合后的血液充入计数室，静置3~5分钟。
2. 显微镜观察- 使用低倍镜找到红细胞计数区域，观察红细胞的形态、大小、颜色等特征。
- 使用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。
3. 结果记录与分析- 记录观察到的红细胞数量、大小、形状等特征。
- 分析红细胞的正常形态和异常情况。
五、实验结果1. 红细胞数量：每升血液中红细胞数量约为4.5-5.5×10^12个。
2. 红细胞形态：呈双凹圆碟形，大小均匀，边缘光滑。
3. 红细胞颜色：呈红色。
六、实验讨论1. 红细胞是血液中数量最多的细胞，其主要功能是运输氧气和二氧化碳。
血红蛋白的存在使得红细胞能够与氧结合，在氧含量高的环境中释放氧，在氧含量低的环境中结合氧。
2. 观察到的红细胞数量、大小、形状等特征与正常红细胞一致，说明本次实验结果可靠。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，避免因操作不当导致实验结果不准确。
七、实验结论1. 红细胞是血液中数量最多的细胞，其主要功能是运输氧气和二氧化碳。
2. 观察到的红细胞数量、大小、形状等特征与正常红细胞一致，说明本次实验结果可靠。
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实验七 脱辅基血红蛋白的制备和重组
一、实验目的
1. 了解生物化学中典型的血红蛋白的性质和结构以及结合在蛋白上的辅基的作用。
2. 学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质代换金属离子的方法。
3. 学习快速扫描分光光度计的使用及紫外可见吸收光谱的应用。
4. 学习柱层析和透析袋脱盐的方法。
二、实验原理
血红蛋白(Hemoglobin)是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种
结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000。四个亚基中，两个亚
基具有相同的氨基酸序列，称为α—亚基，每条链含141个氨基酸，另外两个氨基酸序
列相同的亚基，称为β—亚基，各含146个氨基酸。两种亚基有其各自的二级、三级空
间结构，亚基之间以非共价键结合在一起。每个亚基中均含有一个血红素辅基，血红素
是一个铁原卟啉Ⅳ，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着
非常重要的作用。Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe(Ⅲ)，
则称为高铁血红蛋白，它就失去了可逆载氧功能。
血红素辅基与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括 Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上
的Nε上的配位键；卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白氨基酸侧链之间的盐桥；以及卟啉环
中乙烯基与蛋白的疏水相互作用。在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很
弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。利用高铁血红素在丁酮中
的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋
白分离。分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、
钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。
由于高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱中，在405nm处有很强的特征吸收峰，而脱
辅基血红蛋白只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，
重组成功的高铁血红蛋白又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基
与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。
三、实验方法
1. 氧合血红蛋白的制备(供全班学生使用)
在市血站购买一袋人血，用高速冷冻离心机4000r/min离心10min，取下层血球加四
倍体积的0.9% NaCl洗血球，再用4000r/min离心10min，如此重复2～3次，取下层血
球，按1∶1(v/v)体积比加甲苯，振荡2分钟以上，使血球破膜，8000r/min离心20min，
弃去上层甲苯和中层脂肪，取下层血球沉淀，加10分之一沉淀体积的9% NaCl，激烈振
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荡混合，4000r/min离心10min，弃沉淀，取上层红黑色血红蛋白溶液，再用8000r/min
离心10min，弃上层，取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤，因过滤很慢，可放4℃冰箱内过
滤过夜，然后装透析袋，4℃对H2O透析除NaCl和甲苯，换2～3次予冷的H2O，由透
析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶，取样分析血红蛋白(Hb)的浓度：取5l Hb，加
3.0ml H2O(稀释601倍)，用分光光度计作250nm～700nm的扫描，并检测Hb在415nm、
541nm和576nm处的三个特征峰值：A415、A541和A576，已知这三个特征峰的吸光系数
值为：
415 =125 l/mmol、541 =13.5 l/mmol、576 =14.6 l/mmol。
由公式： 浓度C=(A×稀释倍数)/ ，即可计算出制备的氧合血红蛋白Hb的浓度CHb。
2. 氧合血红蛋白(Hb)氧化成高铁血红蛋白
取已知浓度(约3～6 mmol/L)的氧合血红蛋白2 ml，置于5 ml小烧杯或10 ml试管内
放入冰浴，用下式计算需加入过量1.3倍的K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26)：
用移液管吸取所需加入的K3Fe(CN)6，在缓慢搅拌下滴入Hb内，直到血红蛋白的颜
色从鲜红色变成棕黑色。
装一根1.8cm×22cm的Sephadex G-25凝胶脱盐柱，用10mmol/L pH7.0的磷酸盐缓
冲液平衡脱盐柱，将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱，用4℃H2O洗脱，用量筒收集
高铁血红蛋白，再用H2O将其稀释至1.0～1.5mmol/L (因为过浓不利于脱辅基，太稀又
会脱不完全)，记录总体积，取样稀释200～300倍，作250～700nm的扫描，得重组前
高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图，检测峰值A405。
3.脱辅基 (以下步骤均在冰浴或4℃下进行)
高铁血红蛋白用1.0mol/L HCl粗调，再用0.1mol/L HCl细调溶液pH=1.8～2.0 (这一
步是关键，pH太高，脱辅基不完全，pH过低蛋白会变性)，将溶液置入具塞试管内，加
入等体积予冷丁酮，手摇振荡萃取，静止分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃
取几次，直至上层丁酮无色为止。
取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋，4℃对 1L 5 mmol/L NaHCO3透析0.5
～
1 h，以除HCl，再对H2O(4℃)透析两次，以除丁酮，再对4℃ 200 ml 0.1mol/L pH7.0
磷酸盐缓冲液透析1 h，中间取出透析袋倒置二次（此时会出现少量白色变性蛋白沉淀）。
取出袋内溶液，用8000r/min离心10 min(4℃)，取上层清液，测体积(脱辅基血红蛋
白ApoHb)，立即存于冰浴。取样稀释10～20倍，作250nm-700nm扫描，作峰检测得
A278蛋白吸收峰值，(以0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白
(ApoHb)的浓度CApoHb：
（ApoHb的 278=13.1 L/mmol）
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4. 重组高铁血红蛋白
取3.0ml ApoHb，用0.01mol/L NaOH配制5mg/ml的高铁血红素(Hemin，Mw=651.5) ，
计算Hemin的加入量(过量1.5倍)：
缓慢搅拌下，用10～15min滴加所需体积的Hemin到3.0ml ApoHb中，并在冰浴中
再放置1 h，用1mol/L NaOH粗调和0.1mol/L NaOH细调溶液pH=9～10，溶液颜色变为
棕黑色。
再用G-25脱盐柱脱去过量的Hemin等，脱盐柱用0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液平衡
和洗脱，用量筒收集重组后的高铁血红蛋白，测量总体积，取样稀释后作250nm～700nm
扫描，测峰值A405，最后计算重组率：
由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图，可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重
组后的效果。