蛋白质印迹法westernblot应用介绍
western blotting(蛋白免疫印迹)
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蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
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压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
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主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
western blot技术
百泰派克生物科技
western blot技术
蛋白印迹（Western Blot，WB）也称免疫印迹，是一种基于抗体的蛋白质分析技术。
利用抗体-抗原的特异性相互作用可以在复杂的蛋白质混合物中识别感兴趣蛋白
（目标蛋白质），以实现感兴趣蛋白的定性和半定量分析，在蛋白质表达水平、抗
体活性、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰分析中广泛应用。
WB主要包括以下步骤：
（1）样品分离：利用SDS-PAGE分离蛋白混合物；
（2）转膜：将蛋白条带从凝胶转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的蛋白质生物学活性不变。
转移后的
NC膜就称为一个印迹（blot）；
（3）标记鉴定：用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用二抗处理，二抗是指一抗
的抗体。
通常，第二抗体带有特殊标记，当与合适的底物结合时，会产生可检测的荧光信号，信号强度与膜上的目标蛋白的丰度相关。
通过以上步骤，可以捕获与一抗相互结合的感兴趣蛋白，用于判断感兴趣蛋白的存在与否以及一抗与感兴趣蛋白的相互作用分析；此外，还可根据荧光信号强度对目标蛋白进行半定量鉴定，用于蛋白质白表达水平分析。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC提供蛋白质分析服务技术包裹，包括蛋白质定性定量
鉴定、蛋白质相互作用分析以及蛋白质翻译后修饰分析等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
蛋白质印迹法WesternBlot技术
电泳步骤： 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶 （2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立 即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／ 3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶 凝的更快（30min）。
（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时， 说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒 去上层水，并用吸水纸将水吸干。 （4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED 后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓 缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩 胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直 向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好 拔）。 (5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液 后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃 板内侧）
（1）25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白 标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制 25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用， 也以-20℃长期保存。 （2）1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用 1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL， 按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。 （3）60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水 中，即为60% TCA工作液，使用前配制。 （4）配制BSA标准系列和样品 如表格：
封闭
用5%的脱脂奶粉封闭液 （2.5g脱脂奶粉， 50mlPBST缓冲液）封闭， 在摇床上封闭一小时。
一抗杂交
一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂 奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当 浓度（一抗使用前要3000r／min离心3min）。 将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中 取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗 稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温 下脱色摇床20min,4℃过夜。次日用PBST缓 冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法（Western Blot）是一种常用于检测蛋白质的方法。
其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。
1. 样品制备：首先，待检样品经过蛋白质提取，然后经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。
2. 蛋白转膜：随后，将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物（如聚偏氟乙烯）膜上，形成蛋白质膜。
3. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清白蛋白）的缓冲液中，阻止非特异性结合。
4. 抗体结合：将膜与特异性抗体一起孵育，抗体与目标蛋白质特异性结合。
这些抗体通常是经过免疫动物制备，针对目标蛋白质的特定抗原位点。
5. 靶蛋白检测：使用荧光标记或酶标记的二抗（即与第一抗体结合的抗体）与第一抗体结合。
这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。
6. 信号检测：使用荧光标记物或底物，通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。
常用方法是使用化学发光底物，比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。
通过这个原理，蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。
它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
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(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到 SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋ 槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 － |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|＋
摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或4℃过夜。
Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗 体与抗原的结合。
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一 抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗 孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗 体的说明选择适当的孵育温度和时间。 回收一抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤510分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗 涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤 次数。 注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选 用Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。
Western Blot流程
（1）贴壁细胞蛋白样品收集 A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。 B 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心收 集细胞。 C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心 管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂 解液200μ l于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶 使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30min。 D 裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5 ml EP管中，再用超声破碎仪破碎细胞后，4℃下12000rpm离 心15min，吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。
转膜条件： 推荐：100V ，1—2小时；根据蛋白大小以及胶厚度 的不同而不同。
转膜注意事项
滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润 。
转膜后检测（此步可以省略）
一抗孵育 (Primary antibody incubation)
NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的荧 光二抗， 37 ℃缓慢摇动孵育一小时。二抗需根据一抗进 行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗 小鼠IgG的二抗。 回收二抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟 。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间 并增加洗涤次数。
制胶
制胶过程注意事项：
操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被 冲变型。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡。 分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 插梳子时要使梳子保持水平。
丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸 纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白 探针的Western印迹过程。
封闭(Blocking)
将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白 质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白 质结合。
封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml） 牛血清白蛋白溶液( BSA )
二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)
蛋白检测 (Detection of proteins)
DAB显色 法 化学发光显色法(ECL )
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％）
6 8 10 12 15
最佳分离范围（KD)
50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶（分离胶）
静置1h后制上层胶（浓缩胶） 2、配制上层胶（浓缩胶）白样品 (Protein sample preparation)
分多次将细 胞收至一个 管中
（2）．蛋白含量测定（福林-酚法 ） 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马 斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、 BCA法等。 1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、 300 μ g/mL（用PBS配制）。 样品液：取原液2 μ L至200 μ L （用PBS配制）。 2、操作：先取一块新的96孔板，于630nm下测光密度值 ，取溶液/样品40μ L和E液40μ L，每个浓度点均作三复孔，振 荡混匀。37°C反应10 min后，加入福林酚试剂（1:15稀释） 160μ L，振荡混匀，37°C反应30 min。630 nm下测光密度 值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样 品蛋白浓度。
蛋白质印迹法
（western blot技术）
威斯腾生物技术中心
2014.9.1
Western Blot介绍
Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western Blot 介绍
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治· 斯 塔克（George Stark）。在尼尔· 伯奈特（Neal Burnette）于1981年 所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称 为Western Blot。 蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织 总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特 异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用 于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等 多个方面。